S-6

HITECマウス：鋭敏迅速な体細胞突然変異の検出と解析

権藤　洋一　　（東海大学総合医学研究所）
塩山　善之（九州大学生体防御医学研究所）
勝木　元也　　　（東京大学医科学研究所）

　突然変異を検出検定することによって、環境変異原、遺伝毒性、さらには発がんリスク評価が行われている。また、細胞のなかで、いつどのように突然変異が生じるかという問題は、遺伝学はもとより基礎科学の面からも重要な課題である。バクテリア系を用いるAmesテストや培養細胞系を利用した小核試験など、微細なDNA塩基置換から染色体レベルの大きな変化までさまざまな突然変異を簡便に検出する系が開発され使われている。しかし、そのような変異原が生体内で代謝された場合どう影響を及ぼすか、また、個体の年齢、性別、臓器などの違いによって異なった影響を及ぼすかどうかを調べる場合は、生きた動物個体内で生じる突然変異を直接検出し解析する方法が理想である。
　このための方法として、トランスジェニックマウスを用いた突然変異解析系が近年開発され、その有用性が注目されている。このトランスジェニックマウスには、大腸菌系において容易に突然変異を検出できる遺伝子、例えば、プラーク色の変化や大腸菌の薬剤抵抗性を獲得するような遺伝子が導入されている。この導入した大腸菌遺伝子には、トランスジェニックマウス内で機能するようなプロモーターなどは全くないので、突然変異が導入遺伝子に生じても生じなくてもマウス細胞に影響せず、マウス染色体と同一条件下で突然変異を中立に蓄積するものと考えられる。この導入遺伝子をマウスの各臓器から回収し、大腸菌系に戻すことによって、マウス個体内で蓄積した突然変異を検出するというのが基本的な原理である。また、トランスジェニックマウスから大腸菌へ効率よく戻すことができるように、導入遺伝子はラムダファージDNAやプラスミドDNAの一部としてシャトルベクターの形で構築されている。
　HITECマウスは、突然変異を検出するための野生型大腸菌遺伝子rpsLをもつプラスミドシャトルベクターpML4を導入したトランスジェニックマウスである。野生型rpsL遺伝子は大腸菌系においてストレプトマイシン感受性の優性形質を示す。そのために、シャトルプラスミドpML4を、ストレプトマイシン抵抗性大腸菌に導入すると、大腸菌は感受性に形質転換される。しかし、このrpsLに突然変異が生じていると大腸菌はストレプトマイシン抵抗性のままである。すなわち、rpsL遺伝子に生じた突然変異はストレプトマイシン抵抗性の大腸菌コロニーとして簡便かつ鋭敏に選択検出できるわけである。これまでに、pML4を導入したHITECトランスジェニックマウスを22系統確立した。そのなかで、pML4が350コピーほど染色体の一箇所に同方向タンデム重複の形で導入されていたHIT013およびHIT017の2系統を用いて、トランスジェニックマウスの導入遺伝子に生じる突然変異を解析してきた。
　HITECマウスを用いた突然変異の検定は次の様に行う。まず、目的のマウスの臓器より定法に従ってDNAを抽出する。次に、シャトルベクターpML4を1箇所切断するBanIIでDNAを消化すると、同方向タンデム重複の形で導入されたpML4がユニット長である3.0kbの大きさで切り出される。さらに、T4 DNAリガーゼ処理を施し、大腸菌内で複製できる環状プラスミド構造に戻した後、エレクトロポレーション法を用いてストレプトマイシン抵抗性大腸菌RR1株を形質転換する。その一部をカナマイシン(Km)プレートに、残りすべてをカナマイシン、ストレプトマイシン両方ふくむ(Km&Sm)プレートに広げる。pML4はカナマイシン抵抗性遺伝子を持っているので、pML4によるRR1大腸菌形質転換効率はKmプレート上に生じるコロニー数から推定できる。また、そのうちrpsL遺伝子に突然変異をもつもののみがKm＆Smプレートにもコロニーとして現われてくるので、この二種類のプレート上のコロニー数の比より、目的の臓器における突然変異体の頻度が得られる。この形質転換には、混在するマウス染色体DNAからシャトルベクターDNAをのみを分画濃縮する必要がないので、一日目にDNAを抽出し、二日目にBanII処理からエレクトロポレーションを行い、三日目にはコロニーをカウントでき、短期間で解析が完了する。さらに、Km&Smプレート上のコロニーにはHITECマウス内で生じた突然変異をもつ各シャトルプラスミドがクローン化されているので、それぞれのコロニーよりシャトルプラスミドDNAを抽出してそのrpsLの全塩基配列375bpを決定すれば、どのようなDNA上の変化が実際に生じているかも解析できる。
　以上の方法で、HITECマウスの脳、肝臓、脾脾における突然変異を検討した。いずれの臓器においてもバックグランドの突然変異体頻度は5×10-5程度であった。また、アルキル化剤であるメチルニトロソウレア(MNU)を投与した場合、いずれの臓器も突然変異体頻度の有意な増加がみられ、なかでも脾臓においてもっとも顕著な増加が認められ、脳における増加が一番少なかった。誘発された突然変異体頻度はMNU濃度とも正の相関を示した。得られた突然変異のDNA塩基配列変化は、MNU投与後、細胞分裂している臓器においては、GCからATへのトランジションが多くみられたが、バックグランド突然変異や、投与後、細胞分裂があまりないとおもわれる状態の臓器においては約半数が一塩基欠失によるフレームシフトであった。
　シャトルプラスミドを用いてマウス個体内における体細胞突然変異を簡便かつ鋭敏に検出できる方法が確立できた。HITECマウスを用いて遺伝毒性や発がん感受性を検討できるばかりでなく、各臓器から培養細胞系を確立すれば、全く同じ箇所に同じコピー数でシャトルベクターをもつ異なった組織由来の培養細胞系を利用した突然変異の比較解析も可能である。さらには、DNA分子を導入する方法が確立されている種であれば、動物でも植物でもこの方法は使えるので、この解析系の応用範囲はきわめて大きいと考えられる。