【勝田班月報：６１１２】
《勝田報告》
　１）発癌実験：Rat liver cellに４ニトロキノリンを短期間作用させて、最初の実験では対照に比べ、確かに著明な変化が起り、細胞増殖がいくつものcolonyで起ったのですが､これはその後消えてしまい、そのあと数回やった実験では何れも増殖が起りませんでした。材料にするratに目下純系化しつつあるJAR-ratを使いたいのですが、これが夏から秋にかけて急に繁殖しなくなり、実験が続けられなくなりました。しかし最近また子を生みはじめましたから、12月ごろからまた発癌実験を再開できると思います。
　２）細胞株：馬の肝臓から今年作った株３種と､高木君の株JTC-4から分離したcollagen非形成の亜株１種を、明日の培養学会で発表し、正式に登録するつもりで居ります。猿腎から株ができかけています。12月上旬にpoliovirus感受性をテストします。また12月からモルモット腎の株を作る予定で居ります。モルモットにはほとんど癌ができない様で、その意味でvirusにも癌にも使えると思います。
　３）正常細胞と腫瘍細胞との間の相互作用（parabiotic cell culture)
　生体内ではこの両者の間で相当色々な相互作用が行われているのではないかと想像されますが、その解明の第一歩としてcell levelで相互作用が定量的に掴み得るかどうかをしらべるため、この実験を行った訳です。結果を抄録しますと、まずラッテの腹水肝癌AH-130と正常肝細胞の組合せでは、静置培養でも回転培養（10rph）でも結果は同じに、肝癌は増殖を促進され、肝細胞は阻害されます。また両細胞の液相をミリポアフィルターで隔てても、セロファン膜で仕切っても、ほとんど同じような相互作用があらわれました。つまりこの細胞の組合せでも、相互作用因子は容易にセロフャン膜を通過するものであることが判った訳です。次に吉田肉腫と正常ラッテ心センイ芽細胞との間の相互作用をしらべますと、上とそっくりの結果が得られました。吉田は促進され、センイ芽細胞は阻害されるのです。吉田は回転培養は不適ですので静置培養だけの結果です。系統を変えて、肝癌とラッテの正常腎上皮細胞（皮質トリプシン消化）との間の相互作用をみると、どういう理由か判らないが、この組合せに限って、静置と回転とで結果が相反した。静置では、正常腎はほとんど影響を受けぬのに対し、肝癌はむしろ抑制をうける。回転培養すると、こんどは腎が少し阻害されて、肝癌は増殖を促進される。
　肝癌と正常の心センイ芽細胞の間ではセンイ芽細胞はほとんど影響を受けぬのに、肝癌はごくわずか促進される。次に吉田肉腫と正常肝の間は、正常肝はいつの実験でも殆んど影響を受けなかったのに対し、どういう訳か吉田肉腫の反応は実験をやるたびに異なり、影響を受けぬこともあるし、抑制をされることもある。他の組合せでは再現性があるのに、この実験だけはいつもちがう結果が出ました。肝癌と正常肝の組合せのとき、parabiotic cultureの他に両細胞を直接混合してmixcultureも作りましたが、mixの方が相互作用が強く現れました。細胞が直接相接して何かやっていることが想像され、顕微鏡映画をとってみたら面白いと思うのですが、目下器械が故障していますので来春までとれません。以上の結果を綜合して考えますと、腫瘍と正常の細胞の間には、たしかに細胞レベルでも相互作用が見られること、しかも腫瘍とその起源した臓器の正常細胞との間には何かしら特異的関係があるらしいこと、が判りました。さらに想像をたくましくすれば、腫瘍が転移巣をつくる場合には、機械的にそこに腫瘍細胞が引掛り易いということの他に、そこの正常細胞との相互作用で、増殖しやすいところと、抑制されるところとある。こういう点もかなり影響しているのではないか、という気もいたします。
　癌細胞と正常細胞との間の関係については、中原癌研所長のToxohormone説あり、逆に阪大・久留教授のOncotrephin説もあります。私共の研究結果には腫瘍細胞とparabiotic cultureすることによって正常細胞のmitosisが促進されるような現象は認められませんでした。従って久留教授の云われるOncotrephinは癌細胞が生きている状態では分泌されない物質と考えるべきだと思います。つまり癌細胞乃至各種細胞をすり潰してextractするときのみ得られる物と考えるべきでしょう。

　：質疑応答：
［高木］Mix-cultureで二種の細胞はうまく算え分けられますか｡
［勝田］クエン酸による細胞質のとけ方の相違、核や核小体の形態で、区別できる細胞種の組合せだけがMix-cultureできるわけです。
［伊藤］正常肝の培養に加えて増殖を起し得なかったという、正常肝浸出液や腹水肝癌浸出液の５％というのは？。
［勝田］Volume％です。培地内の最終容量％です。但し、この場合濃度は１種類しかしらべなかったので、抑制はいえても、決して増殖を起さぬとは云えません。また貴兄のやっているように、extractした物質の細胞に対する影響をみる場合には、その結果とin vivoに於ける状態とを考え合わせる必要があると思います。即ち、培養内ではその物質の細胞に対する直接作用をみるわけですが、in vivoでは、一旦他の細胞に作用して二次的に、或は全身的反応をおこして、直接的に影響されるということもあるかも知れないからです。直接的作用をうけない細胞でもね。
［佐藤］mixするときの培地は？．
［勝田］例えば肝癌AH-13と正常肝では、牛血清20％＋ラクトアルブミン水解物0.4％で、同じ培地を使う訳です。吉田肉腫のときは馬血清を使います。
［佐藤］腫瘍転移の臓器特異性を考えておられるわけですね。
［勝田］そうです。
［佐藤］正常細胞が増殖しているような条件では相互作用は如何ですか。
［勝田］まだやってありません。
［伊藤］in vitroで細胞数が維持しているような状態は、in vivoに比すると異なっているのではないでしょうか。
［勝田］成体内の大抵の正常細胞がin vivoで増えていないのは、全身的支配で増殖抑制を受けているのか、或は成長促進物質が体液中に欠けている為か、この二つが考えられる。しかしin vitroに移して、全身的な支配から外してやり、embryonalの細胞が増えるような培地に入れてやっても、adultの細胞は増えない、という結果から考えると、体内では成長促進物質が足りないと考えるべきではないかと思います。そして勿論、正常細胞間でも細胞の種類により、その成長促進物質に何らかの違いのあることは予想されるわけです。成体内では、たとえば肝にしても、正常の状態ではmitosisはきわめて低頻度で、大抵の細胞はきわめて長く生きているわけです。その意味でも、この場合のin vitroでの維持状態というのは、生体内のに似ていると考えてよいと思います。
［堀川］相互作用のfactorが何であるかを追究されるわけですね。
［勝田］正常のchick embryo heartのfibroblastsの成長促進物質をしらべていた時などは、相手が高分子でしかも核酸系がからんできているので、大変やりにくかったのですが、幸にもこの相互作用の場合にはcellophneを通しても作用があらわれる、つまり作用物質が低分子と考えられますので、追究はずっと楽だと思います。そして一歩々々それをはじめているわけです。古川君がいま私の部屋でマウスの腹水系の白血病細胞の培養をずっとやっていますが、腹水移植だと５日位でマウスが死ぬのに、培養に入れると、その白血病が中々増えず、見る見る内に細胞数が減って行ってしまいます。これはやはり培養条件がまだ不満足のためと思います。adultのrat liverと異なり、in vivoでどんどん増える能力を細胞が持っているのですから。
［遠藤］正常肝細胞はin vitroでmitosisがありますか。
［高岡］見たことがありません。おそらく無いでしょう。
［勝田］今年馬胎児肝から３株作ったときにも、３〜４ケ月はmigrationすら見られずにいて、急に株化したのですからね。生きていることは確実です。
［奥村］細胞の生命が、２〜３ケ月も続くとは思われないので、やはりどこかで分裂しているのでしょう。
［勝田］私はそうとは思いません。in vitroでももっと長くすら生きています。かって、やはり馬胎児肝のexplantを培養していたときも、細胞が5､6ケ〜10ケ位ついている処をペンでマークして、図をかいておいても、何ケ月もそのまま形も位置も変らないのです。４月から12月（フラン器の故障）までこの状態がつづいたのです。勿論維持状態です。
［佐藤］培地交新は？。
［勝田］実験の培養では１日おきです。なお、parabiotic cultureに比べtwinD3管の片方に両細胞をmixした方が相互作用が強く出るということは、細胞間の液相を通じてのみの相互作用以上に、直接接触の作用のあることを示していると思います。TWIN-D3は回転培養で、液の撹拌とdiffusionも良いわけですから、そばにいる方が単に作用物質が濃厚に作用するということになりません。また培養そのものも、肝単独だと壁から浮き易いのですが、肝癌とmixすると、浮かなくなります。肝癌に抑えられてしまうのでしょうか。
［佐藤］praimary cultureと株細胞とでは差がありますか｡
［勝田］細胞はできるだけin vivoに近い性質のものでしらべたいのでpraimary cultureを使ったわけです。勿論株の方が使い易いので、この仕事のはじめの頃は、株で基礎的データをとったわけですが。
［佐藤］成長の高い細胞の方に影響が強く出るというようなことはないですか。
［勝田］腫瘍性の強さと相互作用の強さとの比較は将来やってみようと思っています。
［遠藤］Oncotrephinですが、in vivoでも腫瘍内でlysisを起している場合は、細胞内の物質が出てきて実際に作用する可能性はある訳ですね。
［伊藤］その可能性が大きいと思います。
［勝田］Parabiotic cultureでは量比で考えてOncotrephinが細胞内固定性のものと考えるならば、それを考慮しなければならぬほど腫瘍細胞が死んで入れ変わっているとは考えられません。伊藤君がtumor extractを分劃して行くとき、逆にL･P1に抑制的に働く分劃を見ましたか。またそれとOncotrephic fractionとの間に相殺（拮抗）されて０になるような関係は見られませんか。
［伊藤］この間しらべた中に抑制物質の分劃がありました。相殺作用は見てありません。
《堀川報告》
　“組織培養によるＬ系細胞における変異細胞の遺伝生化学的研究・II”
１）Ｌ原株細胞の増殖、DNA、RNA、蛋白合成に及ぼす各種agentの作用機構：
Ｌ株細胞を各種の物理化学的要因で処理すると、ほとんどの場合細胞分裂の異常をきたし、巨大細胞が出現すると共に、長期処理後にはその耐性細胞が分離できます。この巨細胞や耐性細胞の出現機構をしらべ、癌治療における耐性細胞の出現機構の解明に役立てようとすると共に、耐性細胞を用いて、微生物で明らかにされてきた遺伝情報の伝達機構を哺乳動物細胞の染色体レベルで説明できるようにしたいというのがこの研究の目的です。
　ａ）mitomycin-C：Ｌの原株細胞にmitomycinCを加えますと、0.3μg/mlで増殖の抑制が起り核が大きくなり、chromatinの凝集が巨細胞に見られます。0.1μg/ml与えますと、細胞１ケ当りのRNA、DNA、蛋白量が多くなり、DNAはcontrolの３〜４倍にもなります。P32を培地に入れて、そのincorporationをしらべますと、RNA、DNA、phospholipidの何れに於てもincorporationの度合はcontrolの原株と変りません。しかし放射能で見ると、DNAでは減っています。２日後頃からDNA、RNAの比放射能は抑えられます。
　ｂ）核酸合成の先駆物質及高エネルギー燐酸化合物のプールである酸溶性分劃の分析によるMitomycin-Cの作用機構の研究：mytomycinCを0.1μg/ml加えて24時間後、細胞を分劃すると、対照に比べP32の比放射能は、無機燐は多く、ATP、ADP、AMPへのincorporationは低下している。但しATPの量自身は変らない。４日後にはこれらの傾向はさらに強くなるが、ATPの量は変らない。対照実験としてATPをexogenousに与えてみると、細胞増殖は100μg/mlでは抑制されるが、10〜50μg/mlでは少し促進される。但しそれほど大きな促進ではない。
　ｃ）巨細胞内でのDNAreplicationは正常に進んでいるかどうかの試験：DNA、RNAのbase analysisをやってみると、mitomycin-C処理24時間〜４日後でもbase ratisはcontrolと差が見られない。細胞の形態について見ると、mitomycine-CでもCO60でも巨細胞が出現し、さらに処理をつづけると、小型の耐性細胞が出現してくるのです。

２）耐性細胞出現の機構の追究：
　これが突然変異によって現れるのか、淘汰によって残るのか、癌の治療に重大な問題ですが、まず第一に、耐性細胞がきわめて小型なところから、原株細胞の中の小型なものを撰り分けてみるために遠沈によって細かく細胞群を分け、夫々そのmitomycin-C感受性を比較してみましたが､これでは差は認められませんでした。そこでLuria & Delbruck,1943やDemerec,1945,1948等が微生物でやったFluctuotion testをやってみました。１本の瓶から何本もの瓶に植継ぎ、その中の１本から、短試10本に植継ぐ群と、各１本から１本宛植継ぐ多数群とに分けて、感受性を比較してみますと、前者の短試の方が感受性のばらつきが大きく、不偏分散が104となるのに対し、後者の短試は皆似たような感受性で、分散は4.01となりました。同様の実験を中間の継代容器をかえてやってみますと、不偏分散が前者では170.5、後者では0.54となりました。この結果から考えますと、耐性細胞は原株中に既に存在している細胞が淘汰によって出現することを暗示されます｡さらにNewcomebeの法に従いまして、colony形成期にrubber cleanerでまたdisperseして、それを再び培養しますと、対照に比べ耐性細胞の集落が約10倍多く出ます。これもやはり淘汰を暗示します。

　３）各種変異細胞の遺伝的特性、特に交叉耐性の核学的分析：
　Mitomycin-CとUVとは交叉耐性が認められます。mitomycin-C耐性細胞のhomogenateを作り、そのDNAをＬ細胞の培養に入れてみていますが、やや不安定になるだけで耐性系へのtransformationは起りませんでした。次に各種耐性細胞を色々な点で比較してみますと、成長率は、UV-、Mitomycin-耐性株が少し低いのですが、細胞の大きさは、UV-､Mit-､γ-耐性株が小型です。またマウスへ復元接種してみましたが、すべて陰性に終りました。但しマウスは無処置のマウスです。
《土井田》
　染色体分析についての補足：
　染色体数のPeakはＬ原株は63本、UV-耐性63本、8-Aza耐性68本、Mit-耐性63本、CO60-γ耐性47本でした。Mit-とCO60-にはFragmentがみられ、Fragmentの出現％は観察日を変えても余り変化しません。従ってFragment自体も分裂するのではないかと想像されます。Mitomycin-Cの30分、60分処理ではＬにfragmentは出現せず、４日ではcentromerのnotching、fragmentation、polypolar、mitosisが見られます。堀川氏のselectiontheoryが染色体レベルで証明できるかが今後の問題です。

　：質疑応答：
［高木］分析にはルー瓶で何本位お使いになりましたか。
［堀川］10〜20本で、細胞数にして約10の9乗ケです。
［勝田］Ｌにmitomycin-Cを与えると細胞１ケ当りのDNAが増えて行くようですが、対照群のように仮に細胞数がふえたと仮定して、その数で培養当りのDNA量を割ってみると、対照細胞の１ケ当りDNAと同じ位の量になりますか。
［堀川］controlよりは低い値になります。つまりDNAの合成rateも少なくなっています。［勝田］そしてATPはあるけど利用されない訳ですね。
［堀川］そうです。phosphrylationが抑制されているようです。
［関口］phosphorylationの抑制と、DNAの合成阻害との関係をもう少しはっきりさせたら良いと思います。つまりAMP→ADP→ATPの過程にそれぞれＰが関係してPolymerizationがあってDNAへ。この経路でphosphorylationとpolymerizationとのどっちが抑えられるのか、はっきりさせたいものです。
［堀川］分裂の抑制と、DNA合成の抑制とどっちが先かも問題です｡
［関口］それは同じことの裏腹を見ているのではないですか。
［高木］巨細胞はできても、多核細胞は出ないのですか。
［堀川］出ません。
［奥村］Mitomycinを短期作用させたあとでgrowth curveはcontrolと平行していましたね｡１週間の結果はそのようとして、２週間みるとどのようになりますか。
［堀川］増殖曲線は２週間は比較してありません。
［奥村］Ｌ原株の染色体数が63本となっていましたね．Ｊが少し多くて、rodが少し少ないようですね。文献では64本以上が多いようですが。
［堀川］いや、White,Dickson(?)は63本でしたね。
［奥村］どこに差がでてくるかが問題です。
［堀川］我々の細胞では63本は間違いないと思います。二人で別々にしらべてみて、63本のものは矢張り63本となるんですから。
［奥村］Constrictionの形をよく見てやらないと・・・。
［土井田］Ｖをrodにする可能性が多いですね。だから重なっているのを見分けるときなどは、カバーグラスの上からマッチで叩いてみて慎重に確かめています。
［奥村］Fragmentがかなりconstantに出ていますね。idiogramに並べてconstantの位置に出ますか。
［土井田］それは見ていません。どの染色体のfragmentかは判り難いのです。耐性細胞系では全然判りません。
［遠藤］Fragmentationをおこした細胞も分裂できるか、ということですが、Fragmentの無いのが分裂のとき同じ％でfragmentを作って行くということは考えられませんか。
［堀川］重要でない部分にfragmentationを起した細胞が残って行くと考えられます。培地にagentを加えてない時は遠藤氏の云われるような可能性はないと思われます。
［奥村］染色体にsplitの入っていない標本が多いようですが・・・。
［土井田］たしかに中々良い標本ができにくいです。
［堀川］学会が終ったらマウスのprimary cultureでcarcinogenesisの仕事をやりたいと思います。
［勝田］Agentは何を使いますか。CO60なんかが良いんじゃありませんか。
［堀川］ええ、やはり今のようなものを使って、normalのprimary cultureから始めた方がよいと思います。乞御期待というところです。
［遠藤］染色体が各耐性株で異なるのは、selectされた結果とお考えの訳ですね。
［堀川］そうです。
［遠藤］そうするとsubstrainもpureとは云えないということですね。
［堀川］そうです。生命を保つに必要なのは47本位で、あとはnon-essentialのが入っていると考えられますから・・・。
［佐藤］染色体数と増殖率との関係は？。
［堀川］Ｌγは47本ですが増殖率は悪いです。pureになればなるほど、他の条件には弱いような気がします。
［佐藤］吉田肉腫で30本台のを培養して行きますと、60〜70本台になります。Ehrlichでも68本というのがあります。
［勝田］株になると増えるのもありますし、さらに減る場合もあります。
［堀川］株化したものを癌化させるよりも、新鮮な細胞をとりだしてmutagenic agentを加えて癌化させる方がやさしいんではないでしょうか。
［奥村］培養していると最初５倍体位が多くなって、その後に３〜４倍体が多くなってきます。
［佐藤］protein-freeにしてからホルモンを入れてみようと思っています。


《高木報告》
　１）発癌実験：
　JTC-4株にDABを1μg/mlに常時加えて、６月３日から今日に至っていますが、未だに癌化しません。それから、復元の練習をしているのですが、これが中々うまく行かないのです。３週のWistar ratに400rかけ、Cortisone処理して、細胞としてはHeLaS3とJTC-4をrubber cleanerでかき落して10の7乗ケ接種しました。これを３回やったのですが、３回ともついてくれません。こんどはStilbesterolでkidney tumorを作りたいと思い、10月からハムスターの繁殖をはじめました。３週〜１月のハムスターを使って培養をはじめる予定です。これですとポーチも使えますし、復元に便利です。予備実験として、rat kidney cell cultureにstilbesterolを与えて毒性をテストしてみました。100mg/mlにエタノールにとかして、稀釋にtyrodeに入れると、濁ってしまいます。これを稀釋して使ってみましたが1μg/ml迄は使えるような気がしました。またsteroid hormoneの併用を考え、cortisone acetateをしらべましたが、これは100μgが限界でした。virusのsensitivityなども変るのではないかと思っています。目下復元接種の練習に大童です。
　２）免疫学的実験：
　これは杉君がこの間の癌学会で発表しましたが、JTC-4にDABをかけると核の大小不同が目立つようになり、多核細胞も出てきます。JTC-4を嫌気的に培養しても同様です。stilbesterolを10μg入れて３日後ではpyknoticになってしまいました。顕微鏡写真をお目にかけました。免疫実験の結果はanti-HeLa血清とanti-FL血清ではHeLaとFLは＋＋でJTC-4とLは−、anti-JTC-4血清とanti-rat heart cells血清、anti-L血清ではHeLaとFLは−でJTC-4とLは＋＋か＋でした。またこれに使った免疫血清のHA-titerをラッテ及び人の赤血球に対してしらべますと、JTC-4はRat赤血球に4でHuman（０型）赤血球は0、Rat-heart-cellsはRatが8でHumanは0、HeLaはRatが0でHumanは4、FLはRatが0でHumanは64と、何れも種特異性を示して居ります。これ以上進むにはantigenの精製が必要と思われます。京大の岡田氏は発生学研究に蛍光抗体法を使ってきれいな結果を得て居られますが、私はprimary cultureでやってみたいと思っています。
　３）JTC-4細胞の無蛋白培地培養：
　PVPを使ってBSを0.1％まで減らすことはできましたが、それ以上完全にprotein-freeにすることは未だ成功しません。Ｌはきわめて簡単にadaptしました。但し増殖率は週数倍で伝研のほどよくありません。
　４）各種薬剤の影響：
　核酸のprecursorであるorotic acidはこれまでの報告ではHeLa、FL、Ｌには促進効果がないと云われていました。私はJTC-4に10、50、100、500、1000μg/mlの各濃度で影響を見ましたところ、10、50μg/mlの濃度で少し促進が見られました。Changのliver cellの株でも同様です。しかし、HeLa、Ｌ、FLではやはり促進は見られませんでした。
　次に蛋白同化ホルモンのeffectをみたいと計画しています。アナドロン（anabolic steroid）は疲労や胃潰瘍に効くとされています。DOCAも同様の効果があるとされています。fibroblastの増殖が促進されるかどうかです。cortisone acetateではＬもJTC-4も10〜100μgで阻害されます。
　今後進む方向としては、発癌を主体とし、免疫の方もやって行きたいと思っています。
　：質疑応答：
［勝田］Stilbesterolの段階稀釋にどうしてethanolを使わないのですか｡
［高木］Ethanolの毒性がこわいのでTyrodeを使いました。
［遠藤］私の経験ではエタノールの毒性は弱濃度ではあまりありませんから、稀釋に使って大丈夫と思います。Controlに同量のを入れればよいのです。
［関口］岡田氏の蛍光抗体法は50％硫安飽和分劃でのmicrosome fractionがもっともogan specificityが高いと云っています。
［勝田］抗原精製も良いけど、非特異的抗原を完全になくすには材料が大量に必要となりますから、できた抗体の方の非特異的なものを吸収する方法の方が良いんではないですかね。
［堀川］萩原という人がやっていますが、相当むずかしいらしいですよ。
［高木］株細胞だと大分変っているから難しいけれど、primary cultureの細胞なら良いんではないでしょうかね。それからanadrolは傷の治療に使うとfibroblastの促進効果があるというので臨床的には良いような気がするのです。
［関口］肝機能がやられるでしょう。
［高木］normal liverでのshiftだけらしいです。
［堀川］DABの本態は何ですか。
［遠藤］p-Dimethylaminoazobenzenのことです。Butter yellowはcrudeのもので、本体はこれでしょう。
［高木］Stilbesterolの構造は？　anadrolとの関係はどうですか。
［遠藤］anadrolは大分ちがいます。
［高木］あなた方の復元接種のtechniqueは・・・？
［堀川］私のは無処置のC3Hマウスに10の6乗ケの細胞を注射したのです。もっともtumorはできなかったのですが。
［佐藤］私のはＬ株を12匹入れて２匹位tumor様に大きくなったのですが、10日〜２週で消えてしまいました。後は何ともない。
［高木］Hostの細胞の反応とはちがいますか。
［佐藤］そうですね。残生のような形でだんだん死んで行くのです。同じのに何匹も打ってみました。C3HでやるとＬから出たのか発生してきたのか判らなくなるので、腹腔に100〜200万個入れてみましたが変化はないようです。自然発生癌でも移植は中々つきにくいですから、つかぬからと云って癌でないとは云えないし、むずかしいところですね。

《伊藤報告》
　台風の影響で細胞もやられたりしましたので、新しいデータはほとんど出ていません。細胞は最近はL･P1を使って腫瘍のS2分劃の仕事をやっています。L･P1ですとcontrolに比べ、S2分劃を加えた群では７日間にcontrolの２〜３倍増殖が促進されています。S2分劃をトリプシン処理して各種resinを通しますと、IRC50とIR400の非吸着部分は前者は酸性のpeptides、後者は塩基性と若干中性peptidsですが、前者は２倍の増殖促進効果があり、後者は抑制効果があらわれます。IR400を通したとき、非吸着部分を２分劃に分け、吸着部分をHClでeluteして４分劃に分けますと、後者の第１分劃が２倍の増殖促進効果を示します。大体ペプチドの形にしますと、2μg/ml位が促進効果のoptimalです。これらの分劃は夫々５倍稀釋で25倍までしらべました。normalのspleenやmucleにはありませんが、４ケ月位のrat liverには認められます。再生肝では60時間後位が最高でした。Resinをもう少し適当なものを探す必要があると思います。

　：質疑応答：
［勝田］２倍の促進というのは、たとえばconytolが７日間に10倍ふえるところを20倍ということですか。
［伊藤］そうです。
［勝田］normal liverでは何倍位ですか。
［伊藤］やはり２倍位です（S2の段階では）。非吸着部分の比がtumorと正常ではちがっているような感じがあります。
［勝田］有効分劃をさらにpaperchromtographyにかけましたか。二次元の。
［伊藤］Arg、Aspargine、Gly、をcontrolに入れて比較すると有効成分はglycineの処に合致します。
［関口］IR400の分のUV-spectrumの像はいかがですか。peptidesだけで核酸のcontaminationはありませんか。
［伊藤］Ninhydrin発色させて吸収の山をかくと、山の肩の辺に活性があります。
［勝田］大量生産する必要がありますね。色々な細胞でやってみるといいけど。私たちとしては分劃して行くのも面白いけど、他の細胞にもeffectiveかどうかをまず知りたいね。［奥村］Morphologicalな変化は？
［伊藤］特に変らないような気がします。それから牛血清のS2分劃は無効でした。
［勝田］Ｌからの無蛋白培地継代４株に５％に牛血清を加えるとL･P1とL･P2では増殖を抑え、L･P3とL･P4では促進します。
［堀川］そのままずっと続けたらどうなりますか。
［勝田］それはまだやってみません。血清の中には促進する因子も抑制する因子も入っているからprotein-freeの培地で加えてみて、促進なら促進の効果が、血清蛋白と関係のあるものを加えたため、或は蛋白的なものを加えたためでないことを証明しなければなりません。
［伊藤］濃度は2μgN/mlが至適でした。
［勝田］正常の細胞、特にadultの細胞の培養に利用できると非常に有用ですね。他の臓器からも抽出してみましたか。また正常肝をしらべたときのラッテの大きさは？
［伊藤］spleenとmuscleだけは見ましたが陰性でした。ラッテは４ケ月、200gのものです。［堀川］S2分劃の作り方はどうでしたっけ。
［伊藤］HomogenateをNaClで抽出、アルコール分劃法で30〜70沈殿の分劃です。
［関口］核酸が入っていますか。
［伊藤］Starch electrophoresisで分けて有効の分劃は、264mμの吸収は陰性でした。核酸抽出法の分劃では無効です。
［勝田］有効な最後の分劃についてUVspectrumをとってみれば訳ないでしょう。
［伊藤］目下やっています。
［堀川］牛の肝臓などで大量にとったらどうですか。
［伊藤］牛肝は阻害作用の報告がありますね。
［勝田］うちでもやりましたし、古くは癌研の中原さんがやって居ます。

《遠藤報告》
　発癌の実験はまだやって居りません。HormoneのHeLaに対する影響をしらべて居ります。これまで骨の培養にはSalineはGeyのを使っていたのですが、これには他の処方に比べCaもGlucoseも２倍入っているのを使っていましたので、Hanksの処方に変えたところ、HeLaの増殖が非常によくなって、反ってホルモンの効果がはっきりしなくなりました。牛血清５％でも20％でも全然Progesteroneの促進効果が消えてしまったのです。今後は増殖率何倍のとき何％の促進といったような表現をする必要があるかも知れません。どうも増殖率によって成長促進効果が規定されるようだからです。Fig.1とFig.2はProgesteroneの各種濃度のeffectをGeyとHanksのSalineで比較した結果です。Fig.3は、これは一寸変な実験ですが、培養初期に細胞を分注したまま２日間室温において、それから37℃にincubeteしたのですが、２日間は細胞数が減り、以後Controlは回復しないのですが、Progesteroneを入れた群は再び増殖をおこしています。殊に0.64μg/mlの群は最も回復率が高くなっています。このようにConditionが悪いときにむしろ差が出易いわけで、どういう条件のときに影響が明確にでるかを今後検討してみたいと思います。
　次にドイツのあまり大きくない製薬会社で“Regeneresen”という薬（？）を市販しています。fetalとyoungとありますが、主体は各種臓器から抽出したRNAで､organ-specificに臓器の代謝を促進すると云っています。例えば用途に応じ、Osteoblasten、Knorpel、Placenta、Lever用と色々あります。Clinical dataで効くと云っているのですが、Osteoblasten用のを手に入れてテストしてみますと、まずRNAは2.0mg/dl位で、これはChick embryo extract中の含量に略等しくなっています。Chick embryo tibialの培養に0、20、50倍に稀釋して入れてみますと、骨長を基準にしますと、50x稀釋の群が、初めはControlより成長が悪いのですが、直線的に成長が続き、後期にはControlより良くなりました。他の濃度では抑制です。蛋白量は2mg/dl位あります。UV-spectrumをとってみますと、peakが二つあらわれ、純粋のRNAではありません。

　：質疑応答：
［関口］Ethanolを加えて落ちますか。水溶液では不安定と思われますが。
［勝田］核酸だとすると不安定ですね。
［遠藤］proteinは2mg/dlです。
［堀川］Kutskyも同じことをやっていたのではないですか。
［勝田］我々と同じ方向に進んでいた訳ですが、その後RN蛋白をRNAと蛋白とに分け、蛋白の方に活性があると云っていました。
［高木］増殖の悪いときにeffectがよく出るというのは本当ですね。Orotic Acidでも血清５％のときの方がはっきり出ました。
［伊藤］うちでも全く同じことを経験しました。しかし悪い状態のときに効くものを見ていて、本当にそれが意味があるか、という疑問を抱きますね。
［勝田］たしかにsalineの差による影響は大きいと思います。しかも細胞の種類によってその好みがちがうと思います。うちの“D”処方のはAH-130の培養のとき見付けたもので、Tyrodeよりも増殖がよかったので、以後はこれに変えたのです。
［奥村］Glucoseの量が関係しませんか。
［遠藤］Glucoseの量を1/10に下げると、posphorylaseの量が１〜２桁下がるという報告があります。
［奥村］Alkaline phosphataseは？
［遠藤］変っていないようでした。Phosphorylaseの活性が下がるとglycogenの合成は落ちる−ということはあるかも知れませんが、このdataは逆ですね。
［勝田］室温放置の実験、これはまぁその目的でなくやったんでしょうが、そのつもりでもう少し長くやったらどうですか。
［遠藤］勝田氏の処でprotein-freeの培地でHeLaに女性ホルモンをやったら効果が無かったというのは、今考えてみるとHormoneは体内でalbuminにくっついて循環しているということと関係があるのではないでしょうか。

《奥村報告》
　Ａ）Praimary culture：
　1)Monkey：猿はRhesusとCynomolgusですが、Adultではkidney、Embryoではkidney、heart、liver、brain(cerebral cortex)を試みました。Brainは２月位で変性をおこしました。　2)Rabbit kidney：混在virusの検出などの目的でやっています。
　3)Human amnion：人は固体差が大きくて成績が一定しませんので、何か確実な方法を作りたいと思い、目下培地の検討（M･199、血清濃度）、Enzymeなどをしらべています。人羊膜の培養の培地は仔牛血清10％とM･199です。
　Ｂ）細胞及び組織の凍結保存：組織のまま保存できないかと考えたのですが、
　1)Monkey kidney：３回やって３回とも失敗。
　2)Rabbit kidney：２回やって２回とも成功しました。２種類、1立方cmに切るのと、3立方cmに切るのとやってみました。Glycerol濃度は５％、10％、20％の内10％がoptimalでした。あと２％CS+Lact,hyd.+Earle'ssalineです。２週後にtrypsin消化して培養したら増えました。但しinoculumは非常に多くなければ駄目です。例えば生のままですと、20万/mlに入れるのと同結果が40万/mlで得られました。株細胞はまだやっていません。
　3)primary culture：monkey kidneyの細胞を２ケ月間凍結してうまく行きました。しかしこれも固体差が大きいようです。
　なお凍結後のvirus感受性、染色体の変化を目下検討しはじめています。ＬやHeLaは凍結の直後、第１代では染色体像は変化していません。
　Ｃ）培地と染色体変異との間の関係：
　HeLaのcloneS3からさらにcloneを作ってみました。S3は７日間に仔牛血清10％+LYEの培地で8〜10倍ふえますが、作ったcloneのＡは14〜15倍、Ｃは12〜14倍増殖します。染色体はまだ見てありません。仔牛血清濃度を２％に落すと、増殖は７日に8〜10倍になってきました。virusに対する感受性をplaqueでしらべるとあまり差はありません。今後はPVPやfractionVを使ってみたいと思います。
　Ｄ）放射線及ウィルス耐性細胞の染色体分析：
1)ウィルス耐性細胞：1959年中野氏が分離したECHOウィルス耐性のHeLa亜系は、そのままでは染色体数のばらつきが大きいのでcloneを作ってみました。染色体数分布はpeakは次の通りです。E2(70本と90本にpeak)、E5(70近く)、E6(少し少ない方にpeak)、E9(E6と同じ)。耐性系ではCPは殆ど出ません。つまり耐性が維持されています。またE2は染色体像が元に戻りつつあるような感じがしました。またvirus耐性のものとCO60-耐性のものと染色体像が似ています。virus耐性細胞系にCO60の照射を行いますと、1,000レントゲンでは細胞の照射後のviable countは、HeLa(39)、E9(48)：500rではHeLa(52.4)、E2(71.7)、E5(72.0)でした。一回だけの実験なので今後くりかえしてみたいと思います。こうして照射した後は中々増えません。latent infectionを考え、上清をHeLaに入れてみましたが、CPは出ませんでした。
　2)CO60耐性細胞：78本を中心にして広範に分布しています。3,500〜4,000rをかけると70本近、4,000rでは90本近くにpeakがあります。70〜80本にpeakが行き、４倍体がふえています。6,000rから10,000rになるとpeakは70本附近ですが倍数体がふえてきます。倍数性のはっきりしているものは物理的要因に対して抵抗性が強いのではないかと思われます。現在ウィルス耐性の過程を追って染色体をみて行く予定です。Karyotypeを目下しらべて居ります。Ｌで耐性のものにはdicentricのものがありますが、HeLaでもあるかどうかしらべています。

　：質疑応答：
［堀川］ECHO耐性、CO60耐性の染色体peakにふらつきがあるようですが、もともとあるものですか。もっと観察数を多くしなければならないような気がしますが。
［奥村］peakというよりもdistributionのmassとしての特徴ととらえて行かなければならないと思います。
［掘川］大変ですね。Ｌなんかはまだふらつきが少ないんですね。
［奥村］S3はふらつきが少ない点で使っています。
［堀川］Karyotypeに共通性がありますか。
［奥村］あります。HeLaは人由来という点が魅力です。
［土井田］ふらつきのある二つの亜株間の比較は難しいですね。共通点があるというのも難しいですね。
［奥村］統計学的な方法で解決できるだろうと思いますが・・・。
［土井田］僕の方は、Ｌで63本を集団の代表値としてとって、その中で比較しているのですが・・・。
［奥村］peakがはっきりしている場合はそれで良いでしょう。
［土井田］さっき云い落したのですが、63本に対してそのtriploid、tetraploidとして数がぴったり合う細胞が現われるのです。その意味からも私たちのＬの63本という算定は正確なのではないかと思います。
［奥村］DK株というのが、やはり使っていますが、北大の獣医で作ったものだそうで・・・本当に犬からできたものかどうかに少し疑問があります。細胞のContaminationではないかと云われています。
［勝田］それはきっと鈴木君の作ったJTC-5でしょう。変なウィルスがかかるという話もありますね。
［高木］HeLaS3の腫瘍性は・・・？
［奥村］判りません。
［勝田］これからは株を作るときは何か特殊目的のあるときだけ作るようにしないと、維持して行くだけでも大変です。もっとも細胞の凍結保存ができれば楽ですが・・・。その意味からも、凍結保存したあと染色体が変らないかどうかという研究は必要且急を要する問題である。
［奥村］グリセロールを入れる目的は何ですか。細胞内に大きな結晶を作らない為ですか。［勝田］そう云われてますね。夏に学生がやったテストではProtein-freeの株はどういう訳か凍結保存が難しいので一層困っています。
［奥村］高野氏の説ではマウス由来の細胞はGlycerol 5％、ラッテ由来は10％、人のは20％がよいと云う話ですが・・・。
［勝田］あの位の数の細胞をみただけでは、そんなこと未だ云えないと思います。私はむしろ培地中の至適血清濃度と関係ありそうな気がしています。
［佐藤］さっきの人羊膜細胞の培養が中々うまく行かないという話ですが、岡山大小児科の喜多村氏が株(JTC-3)を作ったときは染色体の変化などしらべなかったので、その後何回か培養を試みたがうまく株化しないそうです。非公式の話ですが。
［奥村］私の処では８例中２例は増えていますが、あとは全部だめでした。培地はLhや199、EarleのSalineなどで、この２例は10％仔牛血清+M･199です。外国でもFL以外に色々やって旨く行かないようです。
［勝田］凍結保存ですが、凍結後Nigrosinでviable countをしらべましたか。
［奥村］Monkey kidney cellsで凍結前、生存細胞が20〜24％なのが１ケ月凍結後は8〜14％になります。Rabbit kidneyでは28〜31％が1月後に11〜13％です。
［勝田］高野君のやったのはもっと落ちが多かったと覚えてますが・・・。
［奥村］高野氏のは悪い時が８〜10％、良いときは96％位と思います。最近-90℃の凍結装置を予研で買う予定です。
［高木］植えつぐ直前の時期の細胞を凍結するのですね。
［奥村］そうです。
［勝田］凍結の前後で増殖曲線を比較しなくてはいけませんね。あまりちがうと問題がある。
［奥村］Semiam virus（猿の雑ウィルス）は２週間になって出てくるので、それ迄に使わなければならず、従ってlayが余り長いと問題です。ミドリザルはSemiam virusが非常に少ないのですが、米国ではこれの株を作って、polioの感受性が非常に高いということです。
［勝田］Semiam、特にSV-40はミドリザルの培養でしかCPが出ないので、これ迄気付かれなかったわけですが、雑virusのcontamiはVaccineを作るのに非常に問題になるわけで、今後はその検出の容易な株細胞を作ることも大切ですし、株自身にもvirusのcontamiを起さぬように気をつける必要があります。Semiam virusのことを考えると､いつかはVaccineも、腫瘍性を持たない株細胞で安全に作られるようになると思います。
　問題が腫瘍から外れてしまいましたが、in vitroで腫瘍を作ることと、腫瘍にならないようにしながら長期継代することとは、一つの紙の裏表みたいなもので、やはり我々とは関係の深い問題であると思います。　
　
編集後記

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