《勝田報告》
Ａ）Parabiotic Cell Cultureについて
前報で報告したデータの他に若干の知見を加え、4月1日の病理学会総会で発表しました。そのあと大急ぎでこれを2篇に分けて論文をまとめ、Japan.J.Exp.Med.の6月下旬発行号に入れました。嘗てreplicate cultureでEarle等にタッチの差で先じられましたので、こんどは最もやりそうな相手としてEagleがマークされますが､それにやられないように超特急で論文にしたわけです。これらは何れもTWIN-D1型の培養管を使った静置培養法のデータです。というのはTWIN-D3の量産が仲々間に合わなかったからですが、最近どうやら揃ってきましたのでこれから回転培養の方もはじめます。
前号でHeLaとＬとのIR7(7日后のinteraction ratio)は、HeLa:Ｌ=0.8:1.0となって居りましたが､これらからの無蛋白培地継代亜株各１種宛で比較すると､HeLa･P2:L･P1=0.8:1.0となり、上と略似た結果となりました。次にＬとHeLaを夫々同じ細胞同志で組合わせてしらべて見ますと、Ｌ:Ｌ=1.2:1.2、HeLa:HeLa=1.0:1.0となり、HeLaではsingle tubeでも
twin tubeでも殆んど同じ増殖を示すが、Ｌではtwinの方が若干増殖が良くなることが判りました。これはいわゆるinoculum sizeの問題とすぐ片附けることは難しい。何となれば、細胞１ケ当りの液量はsingle tubeでもtwin tubeでも同じだからである。これが生物学の面白いところでしょうね。何かenvironmentを良くする、それが全く同じenvironmentがとなりにあることに依って促進されるわけで、まさに1＋1=2ではなく、それ以上になってしまうわけです。
次に同じ細胞の組合せで、Twin-D1(静置)とTwin-D3(回転)を比較してみました。細胞はこれまで組合わせてみなかったJTC-1とＬです。その結果は(表を呈示)大体似たような結果が得られました。つまりTwin-D1でも、Twin-D3でも、JTC-1の方が増殖を強く抑えられ、Ｌもどちらの培養法でも若干抑制されるわけです。同じ位の比率になってくれればこちらの註文に合いすぎるのですが、やはりそうは行かないのがこれまた生物学の面白いところでしょう。やはり回転することのeffectが差を大きくするのにひびいてくるのかも知れません。この仕事は今度の組織培養学会に出す予定ですので、せっせと材料を目下ふやしているところです。とにかく相当量データがたまらないと、何とも体系立てた仮説を述べることすら危険だと思われます。
Ｂ）Ｌ及びHeLaの亜株の栄養要求
アミノ酸要求については現在L･P4細胞について各アミノ酸とも2週間宛の実験で必須性と至適濃度を求めているが、その中間報告は今号では省略する。とにかくL･P1とはかなり異なった結果の出ていることをかき添えておく。
これまでＬの亜株はL･P1からL･P4までの4種類であったが､最近L･P4からさらにL･P5と云う亜株を分けた。L･P4はラクトアルブミン水解物と塩類溶液だけで継代している亜株であるが、これを合成培地DM-120に移すと非常によく増殖する。ところがDM-120からビタミンの１種であるNicotinamideを除いても或程度よく増殖する(１週間に6倍位)ので、この一部をとってNiacin-freeのDM-120に入れて継代をはじめた。今度の3月24日から、週に略１回宛継代しているが、大体7日間に約5倍の増殖で、増殖率は低いが安定しているので永続きすると思われる。これをL･P5と名付けているが、NicotinamideもNicotinic acidも含まない合成培地でどうやってDPN合成をやっているか、或はtryptophan→Nicotinic acid→
Nicotinamideのcourseがあるのかも知れないが、簡単には何とか云えない問題である。
HeLaはこれまでHeLa･P1→HeLa･P4の4亜株があり、HeLa･P4はL･P4と同じ培地で継代している亜株だが､これからこんど一部をとって合成培地DM-120で継代の系を作りHeLa･P5と名付けた。始めたのは2月28日であるが､増殖率はまだ低い。しかしこの系も続くと思われる。 Ｃ）新細胞株の樹立
当研究室ではこれまで何とかして馬細胞の株を作ろうとして努力してきたが、4年目になってようやくその成果をあげることができた。まず高岡君は馬胎児腎臓から2株作った。その第１HsK-1(仮称､以下同じ)は1960-11-30より、第2のHsK-2は12月10日より継代している。7日間に3〜4倍の増殖であるが、きわめて安定した増殖を示している。この2系の特徴は､継代の際にトリプシンもEDTAも一切用いず､ただpipetingで剥して継代していることである。次に梅田君が馬胎児肝臓から3系作った。正確に云えば2株と１亜株である。HsLv-1はどうも内被細胞系らしい。Lv-2AとLv-2Bは実質細胞系かと思われる。増殖率はHsLv-1の場合は7日間に約13倍である。培養開始は1960-9-27、1969-10-7(HsLv-2A及び2B)である。ところがこれらに馬の伝染性貧血症の罹患馬の血清をごく少量2日間だけ加えてみると､健康馬血清を加えた場合には変化が見られぬのに対し、3〜5週間目になって上記のHsLv-2A、HsLv-2Bの2系だけは細胞病変があらわれてくるのである。そして前者では核内の空胞、后者では著明な巨細胞の形成と細胞質の空胞変性があらわれる。この他にラッテの腎臓と家兎の肝(実質細胞らしい)からも梅田君が株を夫々１ケ宛作った。
《遠藤報告》
（１）鶏胚浸出液低分子成分および高分子成分の生長促進活性
試料の調製
1)低分子成分(限外濾液)：(図を呈示)図のような装置で、12日鶏胚の浸出液から限外濾液(Ultrafiltrate)を調製した(CEE-UF)。これをメンブランフィルターで濾過滅菌し、凍結して保存した。
2)高分子成分(透析内液)：12日鶏胚浸出液を48時間4℃で透析した。透析は透膜性物質の流出を速めるため7〜9％のPVP溶液に対して行った。膜内液をとり出し凍結して保存した(CEE-R)。
培養
1)培養組織：9日鶏胚大腿骨
2)培地：Control group･･･CEE:HS:GS(1:5:4)
Exptl. group ･･･HS:GS(5:5)
CEE-UF:HS:GS(1:5:4)
CEE-R:HS:GS(1:5:4)
CEE-UF:CEE-R:HS:GS(1:1:5:3)
＊Hs:馬血清、GS:Gey氏塩類溶液
3)培養条件：9日鶏胚の両大腿骨を対照群と実験群に分け、上記の培地で38℃6日間培養した(無血漿回転培養法)。培地は隔日に交換した。
4)測定：長軸生長、乾燥重量、無機燐、ハイドロキシプロリン。
5)組織学的検査：Mayer's H-E、Kossa。
結果
1)長軸生長：実験群はいずれも対照に比べ僅かに伸びが悪い。
2)乾燥重量および無機燐(図を呈示)。いずれも対照より劣る。
3)ハイドロキシプロリン：まだ計算が終っておりませんが、傾向は上と同様のようです。 4)組織学的検査：HS単独、およびこれにCEE-UFあるいはCEE-Rを加えた培地では、骨膜が極めて薄くosteogenic cellは殆ど認められない。これに対し、CEE-UFとCEE-Rの両者を加えた群では、骨膜の像は対照群に近く、osteogenic cellが認められる。
考察
HSにCEE-UFあるいはCEE-Rを加えると、いずれの場合も骨の生長がよくなる。したがって、いずれにも生長促進活性があることは確かであるが、CEE-Rの調製法には多くの問題点があり、さらに良いpreparationを使えばもっと生長は促進されると思われる。しかし、それにもかかわらず、両者をHSに加えると、いずれか単独に添加した場合よりさらに生長はよくなっている。即ち或る程度のsynergismが認められるわけで、これは骨膜については組織学的にも認められる。しかし、このreconstituted mediumでもintact CEEにははるかに及ばない。これはやはりCEE-Rに原因があるように思われる。
以上はなはだ定性的な話であるが、これらは全く予試験的なものであり、今後検討を進めたい。
（２）CEE-UFの定性分析
これもまだ予試験のしかも途中ですが、次の物が確認されました。
1)アミノ酸：His,Arg,Try,Met,CySH and/or Cys,Glu,Gly,Ser,Ala,Asp,Thr,Pro,Leu,(Val),(Lys)｡
2)Purine、Pyrimidineの誘導体：250mμ近辺に吸収のあるものが現在7〜8種分離されていますが、Hypoxanthine、Uracil及びInosineが確認されました。
3)その他：この他、当然のことながら、未確認の物質がかなり沢山検出されています。
《奥村報告》
転勤挨拶、4月13日(木曜日)を最后に現在までいた東邦大学解剖学教室をやめ、予研の腸内ウィルス部(本年4月1日より発足､部長多ケ谷先生)に移り、細胞研究室で仕事を始めることになりました。この部は発足以来日が浅いので現在は各研究室の設営に多忙です。又、部員は臨職の人を含めると60名近くもいるので有機的結合がむづかしく、そのために毎週金曜日夕刻5時位からmeetingをもち、近い将来には研究会に発展させるそうです。ともかく、予研内部は非常に活気があって、私にとって申し分ない勉強の場です。組織培養も専門こそ違うけれども多数の研究室でしており、お互いに研究面で交流をもっている様です。私も新しい環境でもまれながら成長して行きたいと思っています。どうぞ今后共よろしくお願い致します。
L･P1細胞の血清培地継代実験：血清培地継代Ｌ株細胞を無蛋白培地に移して継代したときの染色体の変異を論議する場合にいつも問題になるのは、無蛋白培地継代から血清培地継代に移した時はどうなるかということである。確かに、この問題は非常に重要である。したがって､今後各亜株(無蛋白培地継代)の細胞を血清培地に移し､chromosomeの変化を追究し始めました。その結果、L･P1では血清培地継代2代目頃から高倍性(4倍体､8倍体)の細胞が僅か増え出してきています。主軸細胞(78本)には今のところ殆んど変化がみられない。 L･P4細胞の血清培地継代実験：L･P4細胞は染色体数の分布の点ではL･P2､L･P3の各細胞と非常に類似しているが、核型の点では若干複雑さをもっています。この細胞は血清培地に移すと78本のchromosomesをもった細胞が漸次増加してくるようです。現在のところでは観察metaphaseが22ケだけであるからはっきりしたことは云えないが、バラツキが大きくなると共に78本をもつ細胞が増加の減少をみせ、やはりL･P1でみられたように高倍性の細胞が増加しています。
近日中にL･P2､L･P3の各細胞の血清培地継代の実験をはじめようと思います。
《堀川報告》
組織培養研究グループの皆さん今日は。この度、新しく皆さんの仲間に加えていただきました。今後共にどうぞよろしく。さて、新しい研究所に来て、毎日動物園のクマのようにガリガリあちこちかきまぜて勢力範囲を拡げ、ボツボツ仕事の準備をしております。あれこれ今後の仕事の計画はしておりますが、今直ちにとは行きませんので、この方の問題は次回からにして従来やって来た仕事の概略をまず記して、皆さんの御批判をあおぎたいと思います。
題目：組織培養によるマウスＬ系細胞における遺伝生化学的研究
内容：
最近における微生物遺伝学の驚異的な進歩にともなって組織培養された哺乳類体細胞においても微生物遺伝学で用いられたと同様に細胞のレベルでその栄養要求性や、各種物理化学的要因による変異細胞の分離、さらにはこれらの蛋白、核酸合成の研究を行うことができるようになった。このような実験技術の進歩は同時に微生物において見出された形質転換(Transformation)や形質導入(Transduction)の現象が高等動物体細胞においてもみられるかどうかという興味ある問題にもふれることが可能となった。このような目的から本実験では1943年Earleによってマウス皮下脂肪組織から分離されたＬ細胞を試験管内で培養し、以下のような実験結果を得た。
1)Ｌ原株細胞の細胞増殖および蛋白核酸合成に対する各種物理化学的要因(MitomycinC、8-azaguanine、紫外線)の影響は第１義的には細胞分裂の抑制にあって、DNA、RNA、蛋白合成は比較的非感受性であることがわかった。とくに0.1μg/ml､MitomycinCで処理した細胞は細胞当りの蛋白、核酸量がいちじるしく増加するとともに巨細胞が出現する。
2)Ｌ原株細胞をMitomycinC、8-azaguanine、紫外線で数十継代処理することによりLMit細胞、L8-Az細胞、L-Uv細胞と名づけるそれぞれの耐性細胞を分離した。各種要因の細胞におよぼす作用機構のちがいによって耐性細胞の出現様式は異り、これらの耐性細胞の出現過程の要因のmutagnic actionによるものか単なる選抜、適応によるものか明白ではないが、現在までの知見では各種耐性細胞ともに要因に対する選抜、適応によって出現したと考える方が妥当のように思われる。
3)分離、確立されたこれらの各種耐性細胞はＬ原株細胞に比して、(1)細胞の蛋白、核酸含量、(2)細胞の形態と大きさ、(3)細胞の増殖率、(4)コロニー形成能力、(5)染色体数、(6)各種薬剤に対する感受性などの点でそれぞれ差異を示し、同時にこれらの遺伝的特性は比較的安定していることがわかった。ことにＬ原株細胞の染色体数のピークが68本であるに対して、MitomycinCの耐性細胞(LMit細胞)では62と80本の2ケ所にピークがあることは興味深い現象である。
4)MitomycinCおよび紫外線照射に対してはLMit細胞とLUv細胞が交叉耐性を示し、8-azaguanineに対してはL8-Az細胞のみが耐性である事がわかった。これらの結果はMitomycinCと紫外線の作用機作の類似性を暗示するものである。
5)LMit細胞及びLUv細胞の増殖率はＬ原株細胞とL8-Az細胞からのfilterable substance(セロハン膜濾過物質)によって促進されるが、一方Ｌ原株細胞およびL8-Az細胞はいずれの細胞のfilterable substaceによっても影響されないことがわかった。
6)最後に細胞ホモジネートによる変異細胞間の形質転換(Transformation)を試みたが、一時的なHeteromorphic changeであって遺伝的に安定したものは得られなかった。
今回は少し長くなりましたが、最初だから御許し下さい。今後ともはりきって、ジャンジャンやって行きたいと思いますが、その都度何かにつけて難問をもちこんで皆さんに御迷惑をおかけすると思いますが、何卒同穴のムジナのよしみで、よろしく御協力下さいますよう、最初にあたってお願いしておきます。
《高木報告》
過去一年間MY肉腫より抽出した核酸分劃を主として取扱って来たが、既報の如く、今迄の処、negative dataしか出なかった。これが本当にnegativeなのか、或いはtechniqueの不充分なためかは問題であるが、兎に角RNA、Microsome、DNPなどの抽出法、その他の実験方法については、多少共なれて来た様に思う。
今年度は、昨年度のこれらささやかな経験を生かして、心を新たに再出発したいと思っている。前報において、我々班員の一応の態勢が示されて来たので、もう一度今年度の考えをのべてみたい。
1)核酸分劃を抽出する組織について
私共はまずvirusによるか、若くはvirusくさい腫瘍の組織からRNA、DNPなどを抽出して、それによる正常培養組織の影響を見たいと思い、MY肉腫を選んでみた。今後もなる丈その線にそって行きたいと思っているが、こちらにある動物性腫瘍のステムは限られているので、一応腹水肝癌AH-130及び家鶏肉腫などについて実験してみたい。更にこれと主に2､3､病原uirusについても核酸分劃の抽出をこころみて、それらのinfectivityにつき検討したいと思っている。
2)培養組織について
“正常”と云う意味からはやはりprimary cultureによるものでなければならない。しかも伝研などの御仕事から、培養後出来る丈早期に血清蛋白を培地から取除くことが望ましい様である。MY肉腫の場合は、マウスの胎児の皮筋組織を培養してみた訳であるが、これも厳密には“胎児"と云う事が気にかかる。出来れば成熟動物の組織を用いた方がよいであろう。Benitezらの仕事では、成熟動物のareolar fibroblastを培養して、それに種々臓器からのRNA、Microsomeなどを作用せしめており、ラッテのMicrosomeの方がマウスの
Microsomeよりagentとしてはよりpotentであり、またラッテの繊維芽細胞の方がマウスの繊維芽細胞よりagentに対する影響をうけやすい事を報じている。
しかし私共は、抽出した核酸分劃がactive agentであるか否かをみる意味で、先ず株細胞に作用させてその影響をみ、ついでprimary cultureの細胞に作用させてみたいと思っている。
3)抽出について
RNA：温食塩水抽出法、Detargentを用いる方法などもあるが、やはりPhenol法が一番よい様である。そのPhenol法もいろいろmodificationがある訳であるが、組織をhomogenateにする前にPhenolを作用さすE.Wecker等の方法につき検討してみたいと思っている。
DNA：先には食塩抽出法でDNPを抽出したが、この先の蛋白をはなす方法としてGulland､Jordan､Threlfallらの方法により、即ち食塩でとり出したDNPをChloroform-amylalcoholで振って、蛋白部分を変性せしめ、DNAをとると云った方法を用いてみたい。
4)核酸分劃の作用させ方について
短時間作用させて影響が出れば、それで問題はないが、どうもやはり長く作用させないと効果はあまり期待出来ないのではないかと思われる。(Benitezの仕事では24時間で効果が出たと云っているが)しかしRNAなどは比較的短時間でOligonucleotideまで分解するので、長く作用させると云ってもRNA自体の作用する時間はごく短い事になり、結局はこれの繰返して作用させる事になる。作用させる濃度は50〜100μg/mlが適当と考えられ、作用させる際には血清蛋白を除いた培地を用いたい。PVP＋LYT培地中のRNAの消長については大略はすでに報告したが、更に時間単位でその分解の度合いを検討する予定である。
5)判定の方法について
(1)先ず第一に復元成績の検討であろう。株細胞を作用させた場合でも、これにより有意の差が出れば一応判定出来るのではないかと思う。その有意の差として、予研高野氏の云っておられる様に、もともとある特定の種属にしか復元(若くは移植)出来なかった細胞が、その他の種属のものにも移植出来る様になった場合これは或程度質的(?)なちがいを生じたとも考えられるであろうし、また量的なちがいとしてFoleyなどの云っている様に、移植が成立するに必要な最低細胞数によりその細胞の悪性度(?)の変化をうかがうことが出来るかも知れない。しかし、この復元は株細胞の場合には細胞をふやせばよいので比較的容易かも知れないが、primary cultureの場合の様に細胞数が比較的少い場合にはどうすればよいか･･･勿論１ケの細胞でも復元出来ると云う場合もあるでせうが･･･が問題ではないかと思いますが･･･。
その他の方法もこれに加味して行ってみたい。即ち
(2)形態学的にheteromorphismesがみられるか否か
(3)細胞のDNA含量に比較的変化がみられるか否かmicrospectrophotometryにより行ってみたい。これは紫外部を用いても出来るが､こちらにあるapparatusは不備なため､Feulgen反応で染めて測定してみたい。
(4)免疫学的変化、蛍光抗体法を用いて変化をみたいが、これはまず細胞の臓器特異性が確かめられた上でないと出来そうもない。
(5)染色体数･･･核学的変化。
viral RNAの場合には感受性動物に接種する事により症状の有無で判定出来る。
大体以上の様なことを考えております。御意見がうけたまわれれば幸です。
編集後記
Click [X] after reading.