《勝田報告》
Ａ）発癌実験：
前報で(C-10)の実験までの結果はお知らせしましたので、そのあとのをかきます。
#C11(DAB-8)
Ratがあまり年をとりすぎているとどうもExp群の生えが悪いらしいことに気がついたので、この実験では生后19日のratを用いた。培地は前と同じで、DABはやはり初めの4日間作用させた。第12日にExp:2/5、Cont:0/5の細胞増殖を得て、Exp群の方は現在継代第2代に入って居り、TD-15瓶3ケになっている。5月10日現在で総日数は28日。
#C12(DAB-9)
生后25日のratを使用。DABは4日間。第14日にExp:2/5、Cont:0/5の増殖。
5月10日で総TC日数14日。
［注意］
これらの“増殖"とはすべて上皮性の小型の細胞のことで、箒星状の動きの少い細胞は“増殖なし"の方にも若干出ている。しかし后者の細胞はまずこの研究の場合問題になるまい(結果一覧表を呈示)。なおNo,6203の月報の2〜3頁のあたりをもう１回よくよんでみて頂きたい。新生細胞の形状について記してある。
表をみて気が付くことは、肝部分切除の容易な生后1.5月のratでは陽性率がきわめて悪く､#C7の実験だけが成功している。それと､新生細胞のあらわれるのが､第12日目あたりが圧倒的に多いということである。目下このExpに最もふさわしいratの日齢をしらべているところであるが､それはratの種類によって差がありそうな気がする。また上の新生細胞のあらわれるにも差があり得るのではなかろうか。この研究には､やはり買ってきたratをすぐ使うのではなく自分のところでbreedingをして生ませた仔を使うのでないとうまく行きにくいのではないか､という気がしてきた。なお上のExpはすべて当室のJARを使っている。 #C5、C6、C7の増生細胞は現在TD-15瓶の底に実にきれいなCell sheetを作って、復元を待っています。
Ｂ）ラッテ正常肝細胞の栄養要求：
これは発癌シリーズの第１報として、6月末病理学会で発表するためやっているExp.であるが、Roller tubeで2日間liver explantsを培養した后、Rubber cleanerでかきおとし、80及び150メッシュを通して短試に分注、静置培養している。Ratは20日〜１月のものを使っている。ところが細胞のmaintainはよくされるのだが、おどろいたことには何をやってもさっぱりふえて来ない｡血清を牛､Rat､馬､兎､再生肝のRatと変えてみても同じ｡Rat EmbryoExtractを0､5､10％と加えてみても同じ。ビタミンB12を0､1.5､3､15μg/lと加えても全く同じ。全くあきれ返ったもので、目下最后のチエをしぼっているところである。
Ｃ）仔牛と成牛の血清の比較：
HeLaとMK-D1株でしらべたが､MK-D1では差がなく､HeLaでは4日､7日后に仔牛の方がわずかに良い｡しかし無理して仔牛に変えるほどの良さではない｡7日間のcell countingによる。 Ｄ）サル腎MK-D1株細胞の栄養要求：
どうも数ケ月前とは細胞が少し変ってきたようで、(PVP0.1％＋Lh0.4％＋D)の培地で前には細胞数が減ったのに､4月14日からの7日間TCでは､きわめてゆるい上昇曲線を示している。今回は牛血清の透析内液(蛋白)を電気透析し、その外液をこのPVP培地に加えてみた。(+)(-)各側の外液を単独に加えたのでは殆んど影響がない。両外液を合せて入れると少し曲線が上る｡それにさらに通常の透析外液も添加すると､さらに曲線はよくなり､7日間に約3倍の増殖を示すようになった。つまり血清中の低分子物質の何かを加え､また蛋白に電気的に結合している低分子の何かをさらに加えてやれば、無蛋白培地内で増殖させることは不可能ではない、というメドがついたわけである。そのようなものがLhの中にも含まれているが絶対量が不足なのかどうか､目下PVP培地でLhの濃度を変えて結果をしらべているところである。なおこの株細胞の染色体の検査はこれまで当室でやっていたが､4月から奥村班員が協力してくれることになり、当室では標本の作り方を色々としらべている。
《佐藤報告》
１）発癌実験
ラッテ肝←DABの組合せによるin vitroの発癌実験を班の一員として実験中である。実験材料は呑竜ラッテ(１月21〜23日生れ)、方法は研究連絡月報No.6203に従いました。但し第１実験のみは写真(位相差)撮影のためTD15瓶静置培養です。記載はNo.6204月報勝田さんの記載に従いました。実験結果の判定は後述しますが、全体として私自身の気持として予備的な物とした方が安全と思っています。その積りで読んで下さい。
◇C1(DAB-1)(1962-2-27=0日) ラッテ生后36日±１日
第9日目(1962-3-8)実験群3/5本に、対照群2/5に細胞増殖の開始するのを見た。対照の１例は小型類円形の細胞であった。MCは4日間隔で行い、第13日(1962-3-12)には全部のTDに箒星状の細胞が見られたが殆んど増殖しない。第55日(1962-4-23)実験群4/5､対照群3/5に組織片よりの細胞増殖を見たが増大度が極めて悪い。第64日(1962-5-2)に一部を残存して他は破棄した。ラッテは生存中。
◇C2(DAB-2)(1962-3-1) ラッテ生后38日±１日
第9日(3-10)実験群4/5に軽度の箒星状細胞増殖あり。対照0/5。第23日(3-24)実験群4/5､対照群2/5の組織片周囲細胞増殖。第54日(4-24)実験群3本､対照群2本を残して回転培養中である。実験群の細胞は肝組織片中の肝細胞の円形化、遊離が対照群に比して多い。又一部のものは透明となって光沢のよい細胞となっている。更に又組織片の周囲に肝細胞が横に連なっているものも見られる。未だ継代できる量とは程遠いが対照群より増殖型の細胞は多い。ラッテは生存中。
◇C3(DAB-3)(1962-3-9) ラッテ生后46日±１日
第46日(4-24)実験群4/5、箒星状のものが軽度増殖、又2例は小類円形細胞を混じて居る。対照群1/5。第54日(5-2)増殖極めて悪く実験対照共わづかに増殖型のものを各１例残した。ラッテは生存中。本例は肝細胞のメス切断が未熟であった様に思える。
◇C4(DAB-4)(1962-3-13) ラッテ生后50日±１日
本例は実験群、対照群共に殆んど変らない。小類円形(肝細胞)の軽度増殖が見られる。第50日(5-2)実験群2本、対照群3本宛残し回転培養中。ラッテは生存。
◇C5(DAB-5)(1962-3-19) ラッテ生后56日±１日
回転培養をすると組織片の脱落がおこり、こまるのでゴム栓をして30分間放置したため細胞の感想がおこり失敗？。第35日(4-23)実験群1/5に軽度の増殖を見ている。対照は0/5｡ラッテは生存中。
◇C6(DAB-6)(1962-3-27) ラッテ生后64日±１日
第24日実験群1/5、対照群0/5。第27日(4-23)実験群2/5、対照群0/5。第36日(5-2)やや変性が現われている。ラッテ生存中。
◇C7(DAB-7)(1962-4-12=0日) ラッテ生后79日±１日
第11日(4-23)実験群、対照群共に2/5。fibroblastic cellの増殖を見た。第20日(5-2)実験群、対照群共に5/5箒星状と、小類円形細胞の軽度の増殖を見る。
C6までのラッテはいづれも♂使用、C7ラッテは♀を使用した。
［実験の批判及び今后の方針］
本実験中メスの切り方及びとぎ方について未熟であった点。組織片附着時間の点。組織片の大きさの点。ラッテの生后日数の短縮。等々意に添わない点が多く以上の実験は余り自信がないが、その内で細胞の性質其の他確実と考えられる点を列記する。現れる細胞の形態は箒星状突起の多い偏平な広い細胞質を有し楕円形の核を有する細胞と小類円形(周辺は平滑でない)の細胞が主成分である。後者は肝細胞片の一部のもので明かに肝細胞と移行がみられるから肝細胞性であると考えて差支えないと思う。前者は色々の起原が考えられるが私が分離しているラッテ漿膜？細胞と極めて似ている点は或は肝表面の漿膜増殖を疑わしめる。DAB→肝に対する増殖の差は実験群が対照に比して確かに多い様に思えるが勝田さんの様に未だきれいにいかない。更に継代出来る程の増殖を未だ認めていない。此の点は熟練にも関係する様に思えるがラッテの生后日数にも関係していると思うのでラッテの幼若なものから始めて見る積りである。現在漸く4月25日､4月27日､4月29日､5月2日､5月3日生れの呑竜ラッテを自家繁殖せしめる事に成功したので、同じDAB量で30日以内のものを、メスの切り方、組織片の大きさ等を注意しながら実験を再開します。
２）無蛋白培地の研究。JTC-11細胞の無蛋白培地駲化に成功して現在6日で2.5X程度まで増殖しています。之は勝田さんのL･P1(PVP＋LYD)にあたるもので、表現を同様にしますとE･P1(PVP＋LYE)となります。継代は10万/mlで其れ以下だと増殖が悪く継代困難です。現在PVPの濃度決定及び(PVP＋LYE-Y)を実験中でYeast Extractは無くても継代できさうです。マウスえの復元腫瘍形成は可能です。−病理学会用−
３）高速回転法によるJTC-11k亜株の継代。現在4代目ですが、シリコン樹脂等何も用いなくとも浮遊して増殖しています。JTC-11が腹水癌のために浮遊状の培養が容易なのでせうか。粘液様空胞をもった細胞は継代后2日で静置時に比して極めて多く(5X〜15X)なります。−病理学会用−
４）C3H自然発生乳癌の株化。本例はprimary cultureはトリプシン処理で容易ですが継代が不可能でした。其の后昨年12月7日培養開始の１瓶に結節が生じ現在4結節まで増加しました。他の実験例にも株化のおこり始めているのを発見しました。此の例は勝田さんのDAB腹水肝癌の様に初期にどんどん減少していって後始めて株化する例でせう。之が出来たらC3H自然発生乳癌の培養細胞による予防を行ってみます。
《高木報告》
１）発癌実験
前号につづき発癌実験を行っていましたが、4月12日､13日に廻転培養の恒温装置が故障すると云うaccidentがありました為、残念ながら折角の培養が駄目になりました。修繕されて4月28日、第4回目の実験をスタートしましたが･･･。今回はそれまでの経過を記載します。実験番号を◇C1､◇C2･･･と通し番号にします。
◇C1:(1)K1､D1(Wistar-King ratの肝にDABを作用させた群と対照群)
4月7日(培養42日目)にtrypsinを用いずpipettで剥ぎ落して継代した。K1 4本→4本、D14本→4本、残りの2本ずつはそのまま培地交換だけ行う。
4月11日 培地交換を行っても細胞のoutgrowthは殆ど認められず。
4月15日 2〜3日前よりthermostat切れた由にてすべて変性す。
:(2)K2､D2は植つがずに培養をつづけたが、先般の3月30日に観察した時以上は細胞の増殖はみられず、4月15日に至る。
◇C2:(1)HNS､HNK(hamster腎にStirb.を作用させた群と対照群)
4月7日(培養29日目)にHNS(hamster腎にStirb.作用群)3本→3本、上と同様pipettを用いて継代。HNK(hamster腎の対照群)3本→3本、上と同様。
4月11日(培養33日目)HNS､HNK各１本から各3本ずつに継代。これらは4月15日までは活発な細胞増殖はみられず、ガラス壁についている丈の感じであった。
:(2)HLS､HLK(hamster肝にstirb.を作用させた群と対照群)
前報で有意の差ありと報じたものであるが１週間おくれて4月7日の観察では対照のHLKにも5本中3本にepithelial cellのoutgrowthを認めた｡そのまま観察続行中に4月15に至る｡ ◇C3:K3､D3(Wistar-King ratの肝にDABを作用させた群と対照群)
培養8日目の4月4日D3にepithelialと思われる細胞が少し生えかかっている様であった。対照群と有意の差はなかった。
4月10日(培養14日目)3K 2本→3本、3D 3本→4本にpipettではがして継代する。残りは交換してそのまま培養をつづけ4月15日に至る。
以上から･･･どうも継代がうまく行かなかった様です。これは勝田氏のすでに指摘された如く、時期が遅きに失した為かも知れません。またhamster liverにStirboestrolを作用させた群はepithelial cellsが増殖して有意の差と思ったのですが、それから約１週間後に対照にも5本中3本epithelial cellsの増殖をみました。やはりこれらの細胞を上手に継代し、増殖せしめ復元までもって行かねばならない様です。
◇C4:HNS2､HNK2。HLS2､HLK2。4月28日各10本ずつスタートしました｡
4日目の5月1日にはHLS2､HLK2は細胞増殖みられず、HNS2､HNK2においてすべての培養管にepithelial cellsの増殖(fibroblastはごくわずか)を認めます。
２）(復元)移植実験
先般につづきChang'肝細胞を各800万個、110万個、760万個細胞数ずつtreated hamsterに接種しました。4日目にはすべて1.5x2mm大の腫瘤の発現をみています。
なお先に接種したFL細胞で生じた小指頭大の腫瘤は、接種後3週間目位を境にむしろ退化を示した。組織切片を検討中です。
３）免疫学的研究
目下勝田氏の馬株を増殖中で、免疫を間もなく開始します。
またFL細胞をルー瓶15本に増殖せしめ､Schneiderの方法によりmicrosome､mitochondria､nucleus､その他と分けて凍結乾燥中です。
《伊藤報告》
1)発癌実験
前回に報告した#C1、#C2(勝田研の実験番号に準ず)は、何れも実験開始后30日目になるも細胞増殖を見なかったので中止しました。
#C#(DAB-3)(1962-4-10=0日)
生后10日のWistar rat2匹の肝を用ひ、夫々対照群、実験群(4日間DAB加)6本づつ計24本の長試につけて、roller tubeで培養。6日目より細胞増殖が見られ、14日目では対照群の１本以外の凡てに増殖するcolonyが出来ました。此れでtechniqueに自信が出来ましたので、以后はより成熟ラッテの部分切除肝について実験を行って居ります。
実験のscaleは原則として2匹の“ドンリュー"ratを用ひ、対照群、実験群各6本、合24本としております。
#C4(DAB-4)(1962-4-20=0日)
生后１ケ月♂･･･contamiにて失敗
#C5(DAB-5)(1962-4-24=0日)
生后33日♂ 10日后にK2=1/6､D2=2/6に増殖を認め、その后徐々に増殖して居るかに見えますが、まだsubculture出来る迄に至りません。現在K1:2/6､D1:1/6､K2:3/6､D2:5/6｡
#C6(DAB-6)(1962-4-30=0日)
生后39日♂ 5月9日現在変化なし
#C7(DAB-7)(1962-5-7=0日)
生后21日♂ 5月9日現在変化なし
以上が現在迄の結果です。尚肝部分切除を受けたratは何れも元気で復元される日を待って居ます。今后DABの濃度、作用期間、他の因子とのconbination等検討したいと考えて居ます。
2)制癌剤(特にmitomycin)の作用機作について
まだ始めたばかりですが、HeLa、AH-130(primary culture)、骨髄細胞等に対する作用を、作用時間、作用時期等の面から検討してみたいと考えて居ます。Mitomycinを投与されたpatientの血清等も使用しています｡
3)株化したと思はれる新しい細胞
当大学第一外科でマウスの肋膜腔内に作られた腫瘍でmesodermalのものだと云う事ですが、此れを培養続けて居たところ、増殖が旺盛となり、これをマウス腹腔内に復元して腫瘍を得ました。もう暫く検討して詳しく御報告致します。
4)人癌患者腹水由来の細胞
高井君が従来のものとは別に、♂の胃癌患者の腹水から或種の細胞を培養に移しました。もう少し確かなものになれば、以前の細胞と種々の面で比較する筈です。
5)増殖促進物質
此の方は四月上旬にL･P1にcontami騒ぎがあって、暫く実験出来ず、やっと今月初から再開したところで、今回は御報告するDataがありません。
《山田報告》
デンバーからもどってもう5ケ月になりました。はやいものです。この間今後の実験のための研究室の整備、凍結細胞株の整理などに費やされてしまいました。私の実験にはどうしても必要と部長に請求して購入したCO2-incubatorと倒立顕微鏡が4月になって入り、その調整やらHeLaS3のplating efficiencyのたしかめ、又recloningなどにこのところ忙しく動いております。
この前の班会議で約束した勝田氏の発癌実験の追試をはじめました。まだ第１回を行って陰性、第2回目をはじめたところです。とりあえず第１回目の実験を報告して、皆さんに批判してもらい、よい結果を得たいと思います。私の受持ちはDABによるマウス肝組織の発癌です。
成熟ddY株マウス(5週､体重19.8gm)から肝をとり高岡氏の方法に従って凡そ1mm角に切り出し､塩類液で洗わずにガラス面に附着させました。１試験管あたり10〜20片､この数が多すぎたためかガラス全面に血液細胞と組織破片が附着してどうも観察しにくい状態です。 全試験管数18本､6本づつ3群にわけ､よく附着した所で、第１群にDAB＋Tween20添加培地､第2群にTween20添加培地､第3群に培地のみを加え静置培養しました。DABは最終的に1μg/ml､Tween20は50μg/ml､培地は20％牛血清培地Lactalbumin hydrolysate(0.5%)in Hanks.
Tween20対照を置いたのは少し疑い深いのですが､Tween20そのものが表面活性剤で､腹水肝癌の島を分解して単個細胞浮遊液にする作用が知られていますから、もっとも50μg/mlは上記の作用濃度からみてはるかに低いのですが、使用期間の長いのと、この場合全細胞の解離を必要とせず、組織片の表面の変化だけを期待すればよいので、班員の一人として、一応検討する義務があると考えました。
培養4日間は液かえをせず、その後週2回の割でDAB及びTween20の無添加培地で液かえしました。はじめの4日間でpHはどの群も一様に6.6〜6.8、その後の液かえではpH7.4〜7.6のinitial pHを維持しています。培養4日目頃から僅かですが細胞のmigrationがみられましたが､その後進捗せず､30日間の観察でoutgrowthの発生はどの群も陰性に終わりました。 陰性の結果を得たことについて今考えているのは、一試験管あたりの組織片数が多すぎたためはじめの4日間にpHがさがって組織を障害したのではないかという事です。今後は5〜10片とします。また成熟マウスを使ったことも問題で、勝田氏は生後9日目頃のラットを使用して居られるので、これを踏襲して幼若なマウスを使ってみたいと思っています。さらに根本的にはAzo色素餌食による肝癌発生はラット肝では起りますが、マウスではむづかしいという問題もあります。理くつはいろいろあるわけですが、まづ技術的な問題を片付けないと何とも言えない状態なので、更にくりかえし実験を行う予定です。
編集後記
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