発癌機構の考察：勝田甫
肝細胞にDABをかけると､それまで増殖しなかった細胞が突然増殖をはじめる。明らかに何らかの変化が細胞内に起った証拠である。しかしその細胞を動物に復元接種してみると腫瘍を作らずに消えてしまう。何度くりかえしてみても同じことになる。
ここら辺りで一度、細胞の発癌機構についてじっくり考えてみる必要があるのではなかろうか。発癌は明らかに細胞の不可逆的変化に基づく。そしてその変化は細胞のおかれた環境により淘汰される。悪性化がうまく行かないのは、細胞の変化が不十分（或は不適）なのか、折角悪性化したのが淘汰されてしまうのか、そのどちらか、であろう。細胞の変化について考えると、発癌にいたるのに、細胞は50位のステップを経るという説も最近云われている。動物実験でDABを用いて発癌させるのに何ケ月もかかるところからしらべられたのであろう。動物では、我々の実験とことなり、長い間DABを食わせる。これはどういう意味があるのだろうか。培養のように、あとから余り与えると、折角変った細胞に反って害になる、ということが無いのだろうか。第１段の変化から更に先に進ませるのに、同一物質で充分なのだろうか。しかしその変化に方向性のあることは推察できる。前に報告したが、DABを作用させて出てきた培養細胞に、胆管系の細胞の増殖を促進するような薬剤で追打ちしたところ、新生していた実質細胞がほとんど消え、箒星状のが残った、という事実からである。従って第１撃を加え、以後追討ちをかけるときは、同一方向の物を使う必要があろう。たとえば上に記したような物質はメチルDABのあとに使った方が向いていると考えられる。具体的方策として、とにかく我々はいま一歩のところにきているのであるから、追討ち剤についてよく考え、よく撰んで、色々やってみる必要があると思う。次に淘汰の問題について考えると、いま使っている培地はたしかに良い培地で、色々な細胞の培養に使える。しかしそれ故にこそ反って、ラッテ体内では生きられぬような細胞まで増殖させてしまっているかも知れない。また、これは逆の話であるが、同じくDABを使ってラッテに作った肝癌の一つ、AH-13、これはきわめて悪性で、腹腔内で腫瘍細胞があまり増えない内に、４〜５日でラッテが死んでしまうが、この細胞はいま使っている培地ではよく増えてくれない。この辺ももう一回よく考え直してみる必要がありそうである。
《勝田報告》
Ａ）発癌実験：
これまでの月報に全実験例を記載してきたので、今月は現在まで続いている系列だけを拾って報告する(表を呈示)。細胞はすべてラッテ正常肝。薬剤はDABである。
C6のExp.群の方は明らかに株化した模様であり､対照群もなりかけている。Exp.群の188日(6代)の培養にDAB１μg/mlを再び4日間添加し､以后今日まで30日経つが著変を認めない。 C16の10本の内5本について、１ケ月后にDAB１μg/ml添加(4日間)：今日まで著変なし、3ケ月目に再びDAB第3回目処理をおこなっている。
C18 Subcultureした残りを約5万個/rat宛、9日rat2匹に脳内接種し、現在7日を経ているが未だ変化なし。
C19、C20は念のため、もう一回年とったラッテの肝で発癌を試みてみた。しかしやっぱりうまくないことを確認した。
Ｂ）細胞株の凍結保存：
今夏の学生実習に2年生にやらせた偵察の結果では､細胞はJTC-1､2､8､12､4D､L､L･P1等であるが､次のようなことが判った｡判定はニグロシン染色による生細胞算定と培養によった。 a.凍結の最大のコツはSlow freezingである。(Parkerの本にもかいてあります)
b.(メタノール＋ドライアイス)系でなくとも魔法瓶にドライアイスを入れただけで充分。 c.Cell suspensionはアンプレに入れて封じたり、厄介なことをしなくても、短試にダブル栓をかけ、断熱材で包み、プラスチックの袋に入れただけで大丈夫である。
d.保存液は夫々固有の培地にGlycerol或はDimethyl sulphoxideを10〜20％に加えるだけ。前者はこれまで一般に用いられてきたが、后者の方が少し成績が良いようである。
e.凍結保存中に絶対にドライアイスを絶やさないこと。10年続いた株も１日の不注意で世の中から姿を消すことになる。
f.無蛋白培地継代の細胞は目下のところ未だ旨く行かないが、血清含有培地継代株は比較的容易で、JTC-12(サル腎)などは90％以上の細胞が生き返らせられる。このような場合は“淘汰"などは心配ないことになろう。
この実験は当室の必要性からも、今后さらに続け、実用的にも採用して行く予定なので、さらにテータが得られ次第、月報に報告することにする。
Ｃ）ラッテ腹水肝癌AH-13の培養：
AH-130とまぎらわしいが、この細胞は悪性度が高く、腹腔内でtumor cellsが余りたまらない内に4〜5日でラッテが死んでしまう。腫瘍の悪性原因を拾うと、その内の主なものは二つで、1)活発な細胞増殖、2)腫瘍細胞の毒性作用(toxohormoneのような)であるが、このAH-13は后者の方が強いらしい。その意味でparabiotic Cultureに使ったら面白いと思って手をつけることにした。まだ血清を比較する位のところであるが、硝子壁にほとんど附着しない細胞なので余り有難くない。CS20％＋LDの培地で、4日后に2〜3倍位だが、後は平らになってしまう。RS50％だと約3.7倍(4日后)。それでもマウス白血病のように１日位でぐっと下ってしまって、何をやっても駄目とはちがい、あと血清濃度や色々いじくると何とかAH-130のようにふえるのではないかと期待している。この細胞は壁につかないので、母培養せずに、すぐ実験培養に移している。
Ｄ）サル腎細胞株(JTC-12)の無蛋白培地内培養：
JTC-12を1962-2-7、継代第19代のものを(LD)だけの培地に移した。細胞は増えず、細胞質も次第にやせて行った。-2-15に(PVP0.1％＋BS透析外液10％＋Lh0.4％＋D)の培地に変えたが大した効果はなかった。外液を用意することは大変なので、-3-12に再び(LD)だけの培地に戻し、相不変週2回のRenewalだけは続けてきた。現在約7ケ月経っている訳であるが、-9-11にTD-40瓶の底面の一部をピペットでかき落しRoller tube2本に移してみたところ、かき落した方も、残りのTD-40の方も共に少し増殖の兆候を示している。この分ならば有望であろう。１回でもトリプシン消化して継代できれば、あとは大丈夫なのであるが、目下のところはまだそこまでは行かない。これはウィルス屋の方へのサービスの訳で、できれば合成培地まで持って行きたい訳である。
なお原株の方については、今夏学生実習で大分きれいな染色体の写真がとれるようになった。やはりdouble constrictionがときどき見られる。
Ｅ）ラッテ肝細胞のカタラーゼ活性：
これも学生実習でやらせたのであるが、肝癌と肝細胞をparabiotic cultureして両者のカタラーゼ活性が､対照の単独培養に比べどう変るかをしらべた。培養4日后の細胞を分析したのであるが培養の方はこれまで通り､肝癌は促進され､肝は阻害されるという結果になった。ところでカタラーゼの方は、対照でも大分活性が4日後には落ちていたが､Parabioticの方では測定不能まで落ちてしまった。しかもそれが肝癌、肝両者ともにである。この実験は現在関口君があとをつづけてやっているが、若し事実とすれば、肝癌はparaで増殖促進されていることから考え、カタラーゼ活性は増殖に対するeffectという現在の相互作用の観察点からはさほど本質的なものではない、ということになりそうである。
Ｆ）悪性化の検定にParabiotic Cultureも？
肝癌−正常肝のときのような特異的相互作用が現われるかどうか、DAB実験で株化してしまった細胞や、それに近いものと、正常肝とのParabiotic cultureを目下はじめている。勿論細胞がかなりないと出来ないが、これが旨く行けばcellレベルでの悪性判定の一法に将来なり得るかも知れない訳である。
《高木報告》
１）発癌実験
前報につづき、継代したものについてその経過をみると
◇C6
(1)12日目に継代したものは、S群にのみわずかに細胞の増殖がみられたが、活発な増殖をみるには至らず、継代後64日目で実験を中止した。
(2)18日目に継代したものでも(前報の19日目とあるのは誤り)、やはりS群にのみわずかな細胞の増殖がみられたが、植つぎにたえず継代後58日目で中止した。
(3)22日目に継代したものでは、K群にのみやや細胞の増殖がみられたが、18日目に更に第3代に継代後は殆ど細胞の増殖なく、第3代継代後40日で中止した。
◇C8
18日目に第2代に継代したが、S､K両群共にF細胞の増殖がみられ、第2代継代25日目に第3代目に、S､K両群共3本から2本に継代した。継代後にS群の方がK群より細胞の増殖がよかったが、活発な増殖をみるには至らず、25日後に実験を中止した。
◇C9
(1)11日目に継代したが、K群にくらべS群にF＋F細胞の増殖よく、更に第2代継代後24日目にS群は3本より4本へ、K群は3本より1本へ継代す。継代後S群の増殖は依然よく、24日後に更にS群は2本より3本へ、K群は1本から1本へと第4代目に継代する。第4代継代後はS群にのみ細胞の増殖がみられK群は4日後に実験中止す。
(2)14日目に継代したものでもやはりK群に比してS群に細胞の増殖よく、38日後更にS群は2本から4本へ、K群は1本から1本へと継代するも、S群の増殖は良好で、23日後第4代に継代す。K群は第3代において細胞の増殖みられず7日目に中止した。
◇C9'
38日目に、S､K群共に2本から2本に継代するも、細胞増殖はみられず。7日後に実験を中止した。28日目に継代したものも、前報の如く細胞増殖みられず中止。
◇C11(生后7日目のW.K.rat肝←DAB１μg/ml 4日間)
12日目、細胞増殖D､K群共にみられず。
19日目、D群2/7、K群1/7。
23日目、D群3/7、K群4/7に細胞の増殖がみられたが、これらは以後かえって発育不良となり、ついに37日目に実験を中止した。この原因は牛血清が不良であったためであることが分った。以后rat、hamster共中々仔が生れず、8月下旬にやっと以下の実験が出来た。
◇C12
生后24日目のgalden hamsterの腎にStilb.10μg/ml 4日間作用。
◇C12'
生后24日目のgolden hamsterの肝にStilb.10μg/ml 4日間作用。
◇C13
生后24日目のW.K.rat肝にDAB 1μg/ml 4日間作用
これら3つの実験ではStilb.DAB共予め培地に2日間とかしておいたものを用いた。但し、この3つの実験も始めの4日間◇C11の後半に用いたと同じ牛血清を用いたのは失敗であった。現在、◇C12ではE細胞の増殖が殆どにみられているが、◇C12'、◇C13では有意と思われる細胞の増殖は未だ認められない。
(２）免疫学的研究
CFmouseの血球を用いて､HeLa､FL､Chang､JTC-4､JTC-8(馬株)及びＬ細胞の免疫血清について血球凝集反応を行った(結果の表を呈示)。JTC-4及びＬ細胞の免疫血清について有意と思われるtiterの上昇がみられた｡
《佐藤報告》
月報を書いて皆様にお届けする日になって研究事項がなく只今班長宛電話連絡いたしました処、處期の通りお叱りを受け当然の事と思ひました。5日伝研着の処も1､2日遅れる事と思ひます。全く小生の怠慢であります。御寛恕の程お願いいたします。8月中は実験はしないで、株其の他の必要事項のみに極端に仕事を制限して研究室全員の夏眠を行ったわけです。其の間9月只今よりの準備と継続の実験DAB発癌のみについて7月迄の実験結果を追加しておきます。
DAB実験の継代(実験番号は従来記載したもの)
◇ 8の実験群 TD１本5代、試験管 3本いづれも6代。
対照群 TD15 2本いづれも6代、試験管 7本5代乃至6代。
◇ 9の実験群 試験管 3代１本。
対照群 試験管 2代１本、細胞が少なく結節状に残存。
◇10の実験群 TD15 4代１本、試験管 4本いづれも5代。
対照群 試験管6本、いづれも5代。
◇17の実験群 試験管１本、3代、増殖は余りよくない。
◇20の実験群 試験管１本、上皮性だが増殖はよくない。
◇21の実験群 試験管１本、2代箒星状わづか。
対照群 試験管 細長い結締織系の細胞増殖中｡
◇22の実験群 結節状にわづかに残存。
◇23の実験群 増殖が極めて悪い。
◇8と◇10の復元7月16日 実験､対照共に同腹のラッテに行ったが現在51日目陰性である 以上の結果から(1)大量の細胞を得る事は仲々困難な様に思う｡
(2)メチルDABの細胞は予想外に増殖が悪い｡
9月に入りましたら、実験の再開を致します｡
《堀川報告》
東山の山なみもしだいに秋の色に染り、朝夕はいくぶんかしのぎやすくなりましたが、まだ日中の暑さは相当のもの、今年の夏の京都の暑さは格別で、じっとしていても身体から汗のにじみ出るような毎日でした。従って7月末から仕事の方も全然と云っていい位、はかどりませんでした。だから今月号にはこれと云った報告も出来ませんので、この夏にあった出来事を2､3お伝えします。
１）8月上旬に、ミシガン大学の教授でDr.Foxと云う人が来研しました。この人は現在
Drosophila(ショウジョウバエ)を使って蛋白合成を研究しております。方法はImmunologyのtechniqueを使って種的特異蛋白や雌雄特異蛋白の合成を調べております。今後はショウジョウバエのTissue cultureをやってこの種の問題を更に詳細に解明すつ目的の様です。従来私共がこのような培養をやっていたものですから、これを利用するための来日だったようです。阪大での関西地区の組織培養談話会で仕事の紹介をやってもらいました。
2)次いで8月中旬にエール大学物理化学教室のDr.Kirksonと云う若い助教授が突如来研しました。この人はBacteriophageのDNAのfunctionとstructureを研究している人で面白く愉快な人でした。南禅寺の境内にかりた旅館があまりよくないといってぶつぶつ言ってましたが、自分で来日後交渉して決めて来た旅館だからどうしようもなかったようです。京都地区の若手組織培養グループの席上で仕事の紹介をしてもらいました。その後広島から別府に廻って帰国したようです。こうして暑い暑い京都の地で次から次とやって来た彼氏等のためにくたくたになって京都の名所案内も大変なものでした。今頃になって少し疲れが出て来た様です。
3)8月下旬の22日に、今度はうちの菅原教授がモントリオールで開催される国際放射線学会出席のため渡米しました。何だか来たり行ったりの目の廻るような多忙さです。でもうちの教授は9月28日には帰国する予定です。あちこちの大学および研究室を廻って来る予定にしておられた様ですから、又次号ででもあちらの様子を少しはお伝え出来るかもしれません。
仕事の方はこのような状態でほとんどまとまった事も出来ず以前の仕事の続きとして、[Exp.4]のＸ線照射とDABを併用処理したmouse liver cellをCBAstrain(30日目)の皮下に復元しましたが、これは全然だめでした。少し細胞数が少なかったせいもありますが、今のところ復元は一つも成功しておりません。
実験もやりやすくなりましたので、これから又とりかかります。
これ以外にpinocytosisの実験の方は、EhrlichとSpleen cellの抗血清をRabbitで作るのに暑い時を利用してやりました。これ位が夏場に出来た仕事です。そして何とかこれだけは作り上げました。これを利用して、今後はpinocytosisされた核なりcellがどの程度までhost cellの形質転換に働くか、を決めたいと思っております。Spleen cellは特有のAntigenを持つ様ですが、困った事にEhrlichとＬcellは共通したAntigenを持っている様です。これからabsorptionによって特有なAntigenにしなくてはなりません。
とにかく夏の間はだめでした。何よりも身体だけまあ元気でやって来たことを幸にして、これからの秋にそなえて頑張ります。皆さんお元気で､尚黒田さんも9月末にはDr.Mosconaの所から帰国する予定です。又にぎやかになるでしょう。
編集後記
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