《勝田報告》
Ａ）Ｌ原株及び無蛋白培地内継代4亜株の間の、細胞構成蛋白のアミノ酸組成、並びに完全合成培地内アミノ酸消費の比較
この仕事はすでに今年の初めの月報でも少し報告し、詳細は今秋の癌学会と組織培養学会で発表しましたが、数値として月報に最も新しいデータを示しておいた方が良いと思い、書くことにしました。今年初めの月報のデータと少し違いがありますが、これは培養の状況が少し異なるためです。たとえばL･P3は前の月報にかいたときは増殖が悪いので、あとで実験をやり直したのです。今月号にはその増殖の良いときのデータを示します。
(1)細胞構成蛋白のアミノ酸組成：
acid-soluble fraction、lipoprotein fraction、nucleic acid fractionを除いたあとの、いわゆるcell-constituting proteinsの分劃を、酸水解し、そのなかのアミノ酸組成をアミノ酸自動分析計(KLA-2型･日立)で全分析して比較しました(表を呈示)｡
各株のアミノ酸組成はモル比に於てはかなり似通った組成を示していますが､細胞1,000万個当りの量に換算しますと、5株の間でかなり相違が見られました。L･P1→L･P3に対してＬ株は約2/3、L･P4株は約1/2で、細胞がやせていることが判ります。
(2)完全合成培地DM-120内でのアミノ酸消費像の比較：
DM-120に入れますと、各亜株は勿論のこと、Ｌ原株でも数代の間は増殖をつづけます。DM-120に入れて2日后に培地を交新し、第2日から第5日までに使ったDM-120をアミノ酸分析にかけました。その結果を1,000万個当りに換算したのが次の表です(表を呈示)。
ここでまず目立つのは、定量的な差だけではなく、定性的な相違も見られるということです。グルタミン酸のあとに現われるX1とX2のpeaksがそれで、原株ではX1が現われ､L･P1､L･P2､L･P3はX2が出ます。L･P4はどちらも作りません。X2は恐らくCitrullineと推定され、ureaの全く認められないところから、図の点線のような経路が予想されるわけです(図を呈示)。最近、PPLOがcontamiしていると、この経路が働くという報告があります。しかし当室ではこれまでずっと抗生物質を培地に入れてありませんから、PPLOなどが入ればすぐ判る筈です。だがEinwandを除くために一応PPLOの培養テストも計画しています。
次に面白いのはL･P3のアミノ酸消費で、Arg､Ala､CySH(SerとGluNH2はpeakが重なっているので不明)だけを消費し、他のアミノ酸は合成してむしろ培地中へ出しているということです。だからこのpopulationの中からもっと合成能の強い細胞をselectして行くと、しまいにはglucoseだけで全部作ってしまうような細胞が生まれてくるかも知れません。
上記のように消費したアミノ酸を、それではどれだけの効率で新しく作る蛋白の中に組込んで行くか、ということですが、テストした期間に増殖した細胞数を細胞構成蛋白のアミノ酸組成表にあてはめて計算し、下の式を使って下表のような結果を得ました(表を呈示)。［培養当りの消費された各アミノ酸μMoles］／［培養当りの新しく合成された構成蛋白内各アミノ酸μMoles］。
これをUtilization factor(Mohberg & Johnson;J.Nat.Cancer Inst.31(3):611-625,1963)とよんでいます。つまり取入れたアミノ酸を100％蛋白合成に利用していれば数値は１となり、無駄が大きければ数値は大きくなる。L･P3は最も効率がよいことが判る。
Ｂ）L･P3細胞へのCO60γ照射と、照射后のアミノ酸代謝：
山田班員に依頼してL･P3にCO60γを1,000rx2回かけてもらい(実施表を呈示)、その后、前述と同じ方法でDM-120内のアミノ酸の変化をしらべた。培養はTD-40瓶で、46cmの距離で25rx40分(計1,000r)宛照射した。
第１回の照射后は細胞の変化は認められず、増殖をつづけた。第2回の照射后１w位して少し変化が目立ってきた。22日后に継代したが、細胞は突起が多く、細胞全体が大きくなったように見え、細胞間の間隙も広まってきたように思われた。継代第2日〜第5日に用いた培地をアミノ酸分析に当てた。なお、分析に用いた以外に継代は続けているが、第2回照射后2ケ月頃から、大きさが照射前と同じ位小さく、形態もきれいに整った細胞が散在的コロニー状に出現し、増殖をつづけています。或はこれは耐性細胞かも知れぬと目下たのしみにして増えるのを待っています。
(表を呈示)3日間に細胞1,000万個が消費及び産生した各アミノ酸量を、無照射L･P3と照射L･P3とで比較した。Argの消費が高まり約5倍となり、それに伴いX2の産生も高まって、これをCitrullineとして計算すると、やはり約5倍となっていることが判る。His､Ala､Leuの消費も目立って高まり、逆にThr､Valは産生が増している。
(表を呈示)また､Argをスケールとして､そのCitrullineへの転換比と､合成された新構成蛋白への利用率をまとめた。但し后者は照射されたL･P3も無照射L･P3と同じ構成蛋白のアミノ酸をもっていると仮定しての計算である。無照射の35.5％が照射后はわずかに1.1％となり、照射により蛋白の合成系と分解系との間のバランスが激しく混乱を生じ、合成系もきわめて効率の悪い合成をむやみに行なっていることが判る。
なお、この場合のL･P3はまだ耐性細胞ではなく、上のデータは要するに照射による障害をみたものと考えてよい。いま生え出してきている細胞が耐性であるか否かは別としても、それについても今后またアミノ酸分析をおこなってみたいと思っています。
《佐藤報告》
発癌の判定
我々はDAB或はメチルDABを生体から取りだされた肝組織に短期又は長期に投与して増殖させ(1μg/ml)その細胞をラットに復元して癌をつくらせる方法をとって来た。然しながら現在まで実験例42､ラット数82中､最近脳内水腫をおこした一例以外陽性の結果を得ていない。此等の実験は染色体パターンや細胞群の多型性を判定として続行されている。
今回は安村氏からの提案について復元法の内Suckling rats脳内接種の効力を試みた。色々の方法がありますがまづ第一にAH-130(腹水肝癌で伝研勝田班長の所でJAR系ラットに継代中であり培養株も存在するもの)を分与していただき岡山でDonryu系に継代した動物株で腫瘍性を判定した。現在まだ十分の結果はでていないが実験１､2の表を示しておきます。Exp.AH-Tox.No.1：1963-10-29 Suckling D-Orats 20〜24hours after birth、
Material F1(2)6th day after AH-130 inoculttion：intracerebral 0.03ml。
Exp.AH-Tox.No.2：1963-11-6 Suckling D-Orats 10hours after birth、
material F2(2)8th day after AH-130 inoculation:intracerebral intraperitoneal 0.03ml。現在1,000及び100について実験を続行中です。
親が仔をたべてしまってTumorを確認できないもの以外は、全部13〜16日でTumorをもって死亡しています。この実験が完了し次第、勝田班長に培養株をいただいて培養株→復元の問題について検討する予定です。
DAB発癌については、培地内DAB消耗の確認と10μg耐性株の増殖につとめています。良くいけば12月の班会議に間に合うと思います。
《黒木報告》
Hamster cheek pouch移植法の基礎的研究
．Hamster Mouseの皮下、腹腔内移植との比較
異種移植の部位としては、Hamster cheek pouchの他、睾丸､脳､前眼房､無菌動物(SPF)､新生児動物､胸腺摘出動物等が用いられております。睾丸､脳､SPFについては定量的な研究が少く､その詳細についてはよく知られておりません。前眼房は、Rat､Mouseは小さく移植が困難であり、Rabbit､Guinea Pigは予算の点から敬遠されがちです。更に肉眼的観察に制限があるのも不利な点の一つです。胸腺摘出動物については､今度の癌学会の発表(岡山大･砂田外科･岡谷氏､演説92)及びその追加発言(北大･癌免疫研･小林博氏)を聞きますと､それ程期待出来ないことが分りました。その要旨は胸腺摘出動物ではregressionする時間が4〜5日延長するに過ぎないとのことです。新生児動物を用いることは、H-2抗原の研究からみても可成り期待がもてそうです。このH-2抗原が出産后2〜5日に爆発的に増加することから考えますと、生后24hrs以内の動物を用いることが重要なことと考えられます。(自然､1963･12[免疫生物学のすすめ])今后は新生児と他移植法との組合せ、例えば脳内との組合せがもっと研究されてよいと思っております。
前書きが長くなりましたが、今回はHamster cheek pouchが異種移植部位としてどの程度優れているかを定量的に検討するために行った実験を報告します。
［実験材料］
移植細胞は前回と比較する意味で、吉田肉腫(非培養腹水)を用いました。移植細胞数は1,000万個､100万個､10万個､1万個です。Hamsterは自家生産Golden Hamster体重50〜70g、MouseはC3H/HeN､Rondon breeding,inbred､実中研､大泉Farm生産のものです｡
移植動物及び移植部位の組合せは､次の4種類です。(1)Hamster皮下(SC)移植。(2)Mouse皮下(SC)移植。(3)Hamster腹腔内(ip)移植。(4)Mouse腹腔内(ip)移植。
［実験成績］
１．Hamster皮下移植
ここで、一応陽性と考えたものは、移植後3〜5日目に直径0.8〜1.0cmのやや隆起した表面に血痂を伴った腫瘤を形成したものを指します。これは7日〜14日には完全消失してしまいます。このものが、吉田肉腫の増殖巣であるか否かについては現在組織標本により検索中ですのでそのうち報告出来るものと思います。1,000万個5/5､100万個3/5､10万個0/5｡ ２．Mouse皮下移植
陽性と判定したものは、移植后5日目頃出現した粟粒〜米粒大の腫瘤で、7日目にはすでに消失してしまいます。なお、現在、移植后80日にして移植部位に小さい腫瘤を再び形成したものがあり現在経過観察中です。1,000万個2/10､100万個3/10､10万個0/10｡
３．Hamster腹腔内移植
腹腔内に移植后、3､5､7､10､15日に腹水を採取し、塗抹標本を作成、腫瘍細胞の存在を検索した。このとき、腫瘍細胞の状態により次の四つのGradeに分けた。(-)：腫瘍細胞存在せず。(+)：腫瘍細胞は僅かに認められるが分裂像はない。(++)：(+++)と(+)の中間。(+++)：95％以上が腫瘍細胞､謂るpure culture。
この+++､++､+､-に夫々3､2､1､0点を与え平均を示したものが次の表です(表を呈示)｡
すなはち、1,000万個移植の時にのみ腫瘍細胞の増殖がみられ、100万個､10万個､1万個のときは殆んど増殖しないことが分ります｡
４．Mouse腹腔内移植
Hamsterの場合と同様に経時に、腹水中の腫瘍細胞の消長を追ってみたのが左表です(表を呈示)。Hamsterよりは可成りよいことが分ります。ここでHamster cheek pouch内移植の成績と比較すると次のようになります(表を呈示)。よい順に並べますと Ham.cp》Mouseip＞Ham.SC＞Ham.ip＞MouseSCの順になります。cheek pouchの優秀性がよく分ります。
《杉 報告》
発癌実験：
golden hamster kidneyのculture−diethylstilbestrol
動物実験での発癌には大多数が数ケ月から１年近くを要しているが、in vitroで発癌に相当する様な変化が動物実験よりも早く起るとしてもそれ程早く起るとは考え難い。そうすると少くとも数ケ月間は細胞を盛んな増殖を営なむ或は維持出来る様な状態におかないと発癌に至る変化を起し得ないということになる。そういう意味では今まで行ってきた発癌実験で、株になる程の旺盛な増殖を示した例がないという点を勝田先生が指摘された如く、培養法についてもっと長期間培養出来る様に検討する必要がある。
先ず動物の日齢については実験の最初頃、比較的若い動物を使うと実験群と対照群との間に差が出ないが比較的老齢のものを用いると差が出る傾向にあった為、以後の実験では差を出すために比較的老齢のものを用いました。そのために増殖が思わしくなかったという事も考えられます。生後20日以内のを用いたのは3例あるが細胞数が少なかった為か長期継代に至っていません。腎の場合、若い動物では臓器が小さいため細胞を大量に得る事が困難で、一方老齢ののを用いれば比較的大量得られるが増殖が悪いという欠点がある。従って若いところを沢山集めて培養する必要がありそうです。薬剤濃度と作用期間もまだ検討の余地があるが差し当って先ず年齢を検討してみたいと思います。
そこで少くとも生後20日以内という若いところを使って実験をやり直していますが、この位若いものでは組織片から細胞が出てくるのが早く、10日目には従来markしていた特徴ある上皮様細胞団がかなり出てきます。しかし対照にも量的に稍少いがこれと同じものが見られる。今のところはこの細胞をうまく長期に培養出来る様になれば、培養の間に更に種々の刺戟を加えて目的とする変化を起させ得る可能性は残されていると思います。従って今後暫くは細胞を比較的長期に培養で維持出来る様に主力を注ぐつもりです。廻転培養も数回試みた結果繊維芽細胞が主として出るので中止したがこれも、も少し繰返し行って検討する必要があると思います。hamster肝はtrypsin消化による培養をやり始めたがまだうまくいっていません。
《高木班員アメリカ便り》
勝田先生 この手紙がつくのは丁度TC学会も終った頃だと思います｡ここMemphisも秋の色深く､木の葉の色が誠にきれいです。今日は私がこちらに来てから頂度一年目､全く光陰矢の如しです｡11月6日から3日間､NewYorkで行われた第3回Cell Biolofy Meetingに出席して一昨12日帰って来た処です｡ついでにWashingtonでNIHを､PhiladelphiaでTemple Univ.､Pa.Univ.とAlbert Einstein Hosp.のInstituteを､NewYorkでCoumbia Univ.を駆け足で見て廻りました｡Scaleの大きさではNIHが一番ですが､個々のlab.をのぞいてみると差程ことあたらしいものもない様で､大体私共の処と同じ様なものが並んでいた様に思います｡
Cell Biology Meetingですが､これはNew YorkのGrand Central Stationのすぐ隣にあるCommodore Hotelで行われました。初日､2日目と午前中はSymposiumに平行して演題発表があり､3日目は演題発表丈でした｡何しろ224題と云う出題で､会場も4ケ所に分れて同時に行われましたので聞いてまわるのは中々大変でした｡こちらの学会は勿論発表も大切ですが､お互の社交?という事にも重きがおかれている様で､自分の興味ある演題丈をきいて､あとはお互にdiscusion(話?)をしている人も多かった様に思います｡ 兎も角Molecule Biology関係の出題が殆んどでAutoradiographyによるDNA､RNA関係の仕事とElectronmicroscope関係の仕事が圧倒的であり､又細胞のlysosomeを扱った仕事も可成りあり､Lysosomologyなる新語を云っている人もいた様です｡この学会に関する限り､E.M.は従来のlight Microscope同様に駆使されている感じで､Thymidine､Uridine､Cytidineなど用いたautoradiographyもE.M.で観察した物が多かった様に思います｡第1日目のSympはRegulation of Biosynthesisでしたが､これは同時に私共の処から出題した growth､differentiation and maturation of neuroblastoma cells in vitroが行われた会場にいたため殆どきく事が出来ませんでした｡第2日目のTransport across cell membraneは話をしたProf.の名を一寸忘れましたが､phagocytosisとPinocytosisとの際のcell membraneの態度をEMによりきれいにみせている様でした｡つづいてIonのcell memb.を通しての交流に関する仕事の発表もあっておりましたが､この方は化学に弱い私には少々理解がむつかしい点がありました｡
さて勝田先生のfilmは1日目の午后の3番目(実は4番目ですが､前のが1つ後廻しになりましたので)にありました。Prof.Moskowitzもよく説明しておられたし､写真も他のに比較して中々きれいだったと思いました。liver cellsとJTC-1とのinteractionでJTC-1がliver cellをattackする様にとりかこんだ時liver cellがするりとその中から抜け出した様な場面がありましたが､あの箇所は中々ユーモラスで?､皆の中から思わず笑いがもれました｡またrat heartとJTC-1とのinteractionの場面で､どうもなつかしい形の細胞が出て来た様で､あとでProf Moskowitzにあのrat heart cellsはprimary cultureかと聞きました処､cell lineだとの事でJTC-4だったのか(ではなかったのですか?)とチョッピリ郷愁を覚えました｡質問はありませんでしたが､あとで培地､培養方法､liver cellsの性状(Parenchymか何か)につき聞いている人がありました｡うちのDr.Goldsteinも“中々きれいなfilmだった"と云っており､目下私共のtime lapseが修理中ですので､先生のfilmに刺戟されてか“早くなおす様に業者に今話して来た"などとも云っていました。あとでDr.Moskowitz､Dr.Goldsteinと3人でお互の仕事をdiscussionするchanceを得てまことに有意義でした。堀川氏も出席されているのかと思っておりましたが､御姿をみかけなかった様でした。Dr.Moskowitzは大の日本funの様で、来年も日本に行くから日本語を勉強しなけりゃと云っておられました。Indianaの自分のLab.にも是非来てくれとの事でしたので若しchanceがあれば行ってみたいと思っています｡
先生の処のLP間のアミノ酸消費像の比較ですが先達て(と云ってももう半年前)Dr.EagleがSt.Judeでセミナーを持った時に消費像にあまり差がない様に云っていましたし､株細胞は大体において似た様なものになってしまう様な話をしていましたので私はその点少々反撥を感じておりました｡面白い御仕事だと思います｡
さて私の仕事ですがまずpancreasのcultureはorgan cultureによりAnti-Insulin serumを用いて10〜15日までInsulinの分泌(B cells granule?)をdetect出来る様です｡しかしこれはunspecific stainingとの比較が大切で更に実験をくり返している処です｡これがうまく行ったら括めてみたいと思っていますし､又pancreasのepithelioid､fibroblastic celllineも小さく括めてみたいと思っています｡今度Dr.Goldsteinからrabbit cell linesを用いてのShope virusのT.C.をやってみる様に云われましたので､その方も目下準備中です｡これと平行しanti-rabbit pancreas cell line-rabbit及びguinea pig serumも出来上りましたので、このpurification、cell originの追求もやってみたいと思っています。その他いろいろ他の仕事もやっています(Anti tumor agent“vincristinのTC cellへの効果"をclinicのDr.がやっており、そちらもhelpする様に云われsuggestしています。等々)が主なこの3つです。つまりcell BiologyとImmunologyをまたにかけて仕事をしている訳であぶはちとらずになるきらいもありますが、こちらに来た目的が多くの事を吸収するにあるのですからそれでよいのだと思っております。無理をせぬ程度に頑張りたいと思っています。このInstituteもJapan boomでJapanese Dr.は現在私と共に3人、もう一人金沢大から来られる筈の方はofficial passportをとる時の胸のXrayで陰があったとかで来春にのびたそうです。では又、御健闘を御祈りします。班員の皆様にもよろしく。11月12日
編集後記
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