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【勝田班月報・6302】
《勝田報告》
Ａ）１月はもっぱらThalidomideで終始した。Primary←DABで出てきた細胞を使うのはもったいないので、株化したRLD-1を用いた。
　［サリドマイド濃度］Thalidomideは水に難溶であるが、薄い濃度ではとける。0､1､10､50μg/mlの終濃度でしらべると、1μgでは薄すぎ、50μgでは濃すぎ、10μg/ml位がいちばん手頃である。
　［細胞の変化］撰択的に核に変化が起る。有糸分裂はきれいに2群に染色体が分れず、わきに取残されるものが出てくる。その頻度はかなり高い。そして一旦分裂した核がまたそのまま融合するのであろうか、巨核が現われ、一般的にも核の大小不同、くびれ、こぶ形成、核小体の数がふえ、大きさが小形化･･･などの現象が現われる。特に濃度の高くない限り、細胞質には空胞変性などの変化はほとんど起らない。多核細胞も屡々見られ、巨核細胞は群をなしていることが多い。巨核細胞の分裂像も見られた。また4極などの異常分裂もある。いかにも悪性面をしてきたので、目下これをふやして復元接種する準備をすすめている。またPrimaryのliverにもDABで誘導したあと、そのtubeのままでサリドマイドをかけている。(Subcultureを待つと月日が経ちすぎるので)その結果は未明。
　(模式図を呈示)図は数例の略図を示しただけであるが一般に核の変形は実に多彩である。　［サリドマイド添加日数］1～7日間添加后、第10日にしらべると、１日添加でも巨核は現われるが、出現頻度は低い。綜合して、少くとも4日間位与えた方がよいと判定された。しかし問題は添加を止めたあと、何日間サリドマイドのeffectが残るかである。不可逆的変化を遂げてくれなければ意味がないからである。
　Controlは何十本もの内１本だけ巨核細胞が現れたが、その頻度は培養中でも低かった。同じ株のなかでもCulture flaskにより細胞の性質の異なることを考慮し、Stock cultureは継代のときpoolせずにflask別に継代している。
　RLD-1以外のRat liver株(DAB＋及び－)についても同様のサリドマイド添加をはじめた｡結果は未明｡
Ｂ）ラッテ腹水肝癌AH-13の培養：
　これまでに判ったデータは 1)10％CS＋0.4％Lh＋Saline＋0.01％Pyruvic acidの培地で、7日間は増殖を維持する｡2)血清は､Calf serum､bovine serum､horse serumの内ではCSが最も増殖がよい｡3)Pyruvic acid濃度は､0.005％､0.01％､0.05％の内では0.01％がoptimalである。4)目下calf serumのoptimal concentrationを検討中である。これは3月末までには基礎的データを出し、Normal liver cellsとのparabiotic cultureを検索する予定である。　Ｃ）アミノ酸分析：
　昨秋入った日立のアミノ酸自動分析器がようやくこの頃順調に運転できるようになり、いろいろのアミノ酸分析をはじめている。
　a) L･P1→L･P4の4亜株細胞のアミノ酸消費及び細胞蛋白構成アミノ酸組成を比較している。アミノ酸消費は､合成培地DM-120中で培養したあと､培地のアミノ酸の種類と量を測定し､培養前の培地と比較するのである｡Eagleによると､色々の株細胞が皆似たようなアミノ酸要求を示すように報告されているが､我々の得た結果では同一のＬ株から枝生した4亜株の間にさえ､かなりの特異的な違いのあることが判った｡つまりEagleのようにproteinを少し加えた合成培地でなく､純粋の合成培地でしらべているので､proteinからのliveration(or contamination)を除去できてこのような差を見出すことができたものと思われる。蛋白構成アミノ酸についてはなお検討中である。
　b) マウス移植性白血病(腹水型､C-1498)の細胞蛋白構成アミノ酸の組成：
　2年ほど前からこの細胞の培養を試みているのに、仲々成功しない。よほど変った栄養要求をもっているにちがいないが、現在まで用いられたあらゆる培地を試みても旨く行かないので、細胞を集めてその蛋白を分離し、さらに酸分解して、アミノ酸組成をしらべてみた。その結果、第一に判ったことは、他のＬ系などの株細胞に比べ、各アミノ酸の細胞１ケ当りの含量がかなり低い(1/4～1/6)。細胞の形態もきわめて小さいが、分析値でもこれが示され、次に組成の大きな特徴はmethionineがきわめて少ない(≒0)。酸化されたとしてもmethionine sulfoxideが殆んど出ない。Cystineも少い。大変面白いのでヒト白血球についても目下検索中。

《佐藤報告》
　前号に引きつづき株化されたものの染色体数分布を検索していました。
(染色分布図を呈示)今回はC22:C21:C20:の三例を見ました。詳細な検討は2月14日上京の班会議で御批判いただく事にしますが、極めて興味のある事はC22実験でDAB“発癌"の場合には42より左より(少数の方)に染色体数が分布しますが、同じ実験(同じラット)でメチルDABを使用した場合には明かに右遍(増える方)している事です。この株はメチルDABのみで発癌している可能性を追求します。
C21 contr.は前号記載の如くExp.の株はありませんが、形態的に明かに“箒星状細胞"であります。（染色体数分布は42が最頻値で44､45にもピークがある）
　C20 Exp.は前号記載のものと同様DAB“発癌"のものであるますが、前回のものと同様42より左遍しています。
　染色体数分布については勝田さんの謂われる様に精確にしなければならないと思いますが、42染色体数のものは比較的に美麗にみとめられます。42染色体数が現われる頻度はどうもラッテ日齢(実験時)で関係する様に考えられます。
　DAB短期投与の実験◇C36､◇C37は夫々6日目､2日目で未だ結果がでていません。
　C10Exp.株のラッテ血清(20％)駲化は仲々むつかしく牛血清と交替にして継続しています。C10Exp.株は一部5％LD牛血清で継代中で、これとラッテ血清で比較して見ます。ラッテ血清を2日間程使用すると、細胞に変性がおこり、後で牛血清に戻ししてもpolymorphieが長くのこっています。

《杉　報告》
　昨年末から今年始めにかけての発癌実験のdataを大ざっぱにまとめますと
　golden hamster kidney←stilbestrol
　Exp.1　生後28日、S(1μg/ml)、培養4日－18日間・22日目。14日目：S群Eが優勢のもの3/6、C群Fが主。22日目(第2代へ､RT6本→2本)。第2代・5日目：18日目：S群2/2、C群1/2、概してS群の方が細胞が多い。32日目：両群共増殖の兆なし。41日目：細胞殆んど脱落。
58日目：培養中止。
　Exp.2　生後36日、S(1μg/ml)、培養初日－22日間・22日目。18日目：両群共にFが主で両者間に差なし。22日目：S群2/6にEが中等度。42日目(第2代へ､RT6本→3本)。第2代・12日目：両群共3/3、但しS群の中１本はE多し。22日目：S群で優勢だったEが不明瞭となったがS群はC群に比べ明らかに細胞多し(S群１本破損)。29日目：両群共にFが主であるが、C群に比べS群は細胞多し。30日目(第3代へ､RT3本→3本)。
　Exp.3　生後81/2moth､male、S(1μg/ml)培養初日－10日間・10日間。7日目：S群10/11､C群5/11少し。14日目：S群11/11、C群7/11、Fが主。中等度。
　Exp.4　生後103日、male、S(1μg/ml)、培養初日－6日間以上。4日目：S群5/10、C群4/10、極めて少し。
　golden hamster liver←stilbestrol
　Exp.1'　生後28日、S(1μg/ml)、培養4日－28日間・32日間。27日目：S群2/6、C群1/6、E少し。32日目：S群2/6、C群細胞殆んど(-)。63日目：S群も細胞変性に傾く。73日目：細胞殆んど(-)。
　hamster liver←Sのsystemは動物実験でpositiveのdataがありませんので可能性は薄いとみてExp.1'だけで中止しhamster←Sについては専らkidneyだけにしぼってやることにしました。Exp.3と4はoldのhamsterを用いました｡理由はhamsterが最近の寒波異変のためでもないでしょうが増殖が思わしくないためyoungが不足しているのと、liverに比べkidneyは比較的よく生えるので思いきりoldのを一ぺん試みに無駄を覚悟でやってみたわけです。youngなものに比して生えが遅く使えるかどうか分りません。どうせ復元にもっていくのだからやはりyoungなところで増殖の盛んなのを捉えるべきでしょうか。今までのところ、golden hamster kidney←Sに関しては対照群より実験群の方がいつも少しいい様です。しかしまだまだはっきりと差をあらわす旺盛な増殖といったものは認められず、作用期間、量、又更には第2のfactorと検討を要する問題がありそうです。更に例数を重ね検討したいと思います。

《山田報告》
　DABを組織培養系にもちこむためにはどうしても滅菌しなくてはならないわけですが、高木先生によって紹介された100℃30分3回の間歇滅菌でDABが破壊されないかどうか、もしこれでこわれないのなら10lb10分の高圧滅菌で簡単に滅菌できないかどうか、そのような極めてprimitiveな事を確かめるために滅菌前後のDAB液の分光吸光曲線を調べてみました。DABそのものの吸収曲線は10-4乗MのDABのEthanol溶液で調べた所、410～412mμに最大の山があり、これがN=Nによるものである事がわかりました(図を呈示)。Tween20には特異な吸収はありません。そこで410mμの吸収度を基準に100℃30分の加熱の影響をみた所(班できめた方法でDABをTween20にとかし、アミノ酸・ビタミン塩類溶液で稀釋したものについて)殆んど影響のない事がわかりました。10lb10分高圧滅菌した場合には410mμの山が約40％低下し、他の消長には殆んど影響がないので、DABのやく40％が高圧滅菌によりN=Nのところで破壊されることが明らかにされました。残念ながら滅菌の簡易化は不成功に終ったようです。DABの蛋白と結合した場合には別のところに山がでてまいります。ただ問題は血清の色が黄－橙のことで、全液については簡単に測定されません。(Phenol Redは除けますが)。又410mμの吸収で細胞内の分布を測定できないか、(あるいは蛋白と結合した500mμ～の所で)、考えていますが、濃度の問題で限界がありそうです。尚､DAB液を氷室保存中にDABの結晶が晶出してくるため、そのまま分光計にかけますと吸収度が低下しています。もしこの場合DABがAmino酸と結合したために低下したのなら別の山が現われる筈ですが、これは認められませんでした。細胞に対するDABの影響を定量的にみるためには小さい事ですが、まだ色々と問題がありそうです。

《堀川報告》
　培養細胞における貪喰性と形質転換（癌化）の試み（　）
　(1)正常Ｌ細胞がH3-thymidine labeledマウスSpleen細胞を貪喰した際、貪喰後急速に、Spleen細胞のH3-labeled-DNAをＬ細胞核に吸収してしまうことは(　)報で報告したが、これはhost側のＬ細胞のcytoplasm内に存在するDNaseによってSpleen細胞内のDNAが分解されＬ細胞自体のDNA合成に使用されるものであろうと云う可能性を暗示した｡今回は同様の方法でマウスSpleen細胞をC14-DL-leucineでlabelし､これをＬ細胞に貪喰させた後のC14-proteinの挙動を追求した。H3-thymidineの場合と異ってC14を使用した場合はAutoradio-graphyの解像力が悪く、そのdetectionが容易ではないが技術面を改良して得た結果は要約して次の様になった(図を呈示)。C14-leucine labeled mouse Spleen cellsとＬを同一Medium内でcultureすると、Ｌ細胞のSpleen細胞の貪喰はincubation後3～5時間目頃からみられ、Spleen細胞のC14-proteinは始めはＬ細胞のcytoplasmにtransferされるが、以後Ｌ細胞の核、又は主として核周辺に集まることが分った。これらの結果と(　)報の結果から綜合して、貪喰されたSpleen細胞のDNAも更にはproteinもhost側のＬ細胞に吸収され、恐らくＬ細胞自体のDNA､protein合成に利用されることを意味しており､transformationの可能性を暗示するものである。然し、この場合あくまでSpleen細胞のDNAがＬ細胞内のDNAの一部分とreplaceしてtemplateとしての作用をもち､数十継代分裂後のＬ細胞にもSpleen細胞のCharacterを維持し続けるか否かは今後の大きな問題であると思われる｡
(2)Ehrlich細胞核をＬ細胞に貪喰させた場合、どの様な形でEhrlich細胞DNAがＬ細胞核にincorporateされていくかを決定することは､形質転換の解明上まずやらねばならない問題である。現在予備実験として、Ehrlich細胞DNAをP32でlabelして､そのDNA､RNABaseごとのP32activityを調べ､Ｌ細胞が貪喰した場合どの様なEhrlich cell DNAのBase componentをとり入れるかを決定している。この結果は、現在の段階では予備的なもので次回に報告をゆずりたい。
　(3)前回の班会議で報告しました0.4μdiffusion chamberを使ってのin vivo cultureは現在土井田君を中心にして仕事が展開されており、これまでin vitroにのみ全てをたよっていたculture法が生体内培養と云う恵まれた環境の応用により、発癌問題の2stepの突破にも大いに利用出来る可能性が出て来た。
　然しmouseのstrainによってin vivo cultureの容易なもの、手術に対してresistantなものsensitiveなものなどがあって現在それの基礎的dataの集積中です。
いづれ近い内に御報告出来ると思います。

《遠藤報告》
　昨年はさぼりにさぼって除名の憂目にあい、辛うじてお情けで名前だけとどめて戴けることになりましたが、“一年の回顧反省"は、確かにこの班の究極の目標でありしかも既に突破口は開かれた目標であるin vitroの発癌に対し積極的に何も貢献できなかったという事実に対する悔恨の一事に盡きます。そこで、さぼりながらもこの一年間多少勉強し考えてきたことを“きたるべき一年への抱負"として書いてみます。
(1)これまでにやられてきた方法をそのまま踏襲しても何もできそうにないこと
“The Morphology of the Cancer Cells"““Biochemistry and Physiology of the CancerCell" “An Introduction to the Bio-Chemistry of the Cancer Cell”その他いろいろあさってみても、結局のところはじめからわかりきった癌の多様性と正常との間に決定的な差異がないという事実を再認識するにとどまり、過去の方法論にのっとるばかりではこれらの知見に同質のものを加えるだけであることがよくよくわかりました。
　その点、in vitroの発癌という試みは全く新しい戦術であり、膠着した対癌戦線を切り崩す有効な方法の一つであることもよくわかりました。
　しかし､この場合､発癌を判定するマーカーとしてAtypismその他いろいろのbiological behaviorをとるとしたら、これまでの専門からして私にはかなり不利である。それでは、何かbiochemical characteristicsをといっても、現状specificなものは何もない。
　そこで従来とは少し違った観点を持ち込んでbaiochemicalに発癌に到る過程を追ってみたいと考えるようになりました。違った観点というのは､私の分担課題になっている《内分泌学的》ということです。
（２）発癌に内分泌因子の関与もありうるということ
　これまでは、ホルモンのTarget organの癌以外では、発癌や育癌に内分泌因子をあまり考えていないようですが、ホルモンのtarget cellもnon-target cellも同じgene構成を持っているのであるから、cellular controling mechanismによって量的にmodifyされているにしても、ホルモンがnon-target cellにもmetabolicalに何か作用していることは当然考えられます。とすれば、普通はhormone dependencyを考えない発癌や育癌にも内分泌因子が関与していることは充分考えられます。
　これがDAB肝癌の場合にもあてはまらないでしょうか。勿論考えられるから、勝田さんの所では既にDABの後処理としてtestosteroneやgrowth hormoneを使っているわけですが。　これに関連するこれまでの知見を二三あげてみますと、
1)DAB肝癌発生における性差の問題
　昨年10月の癌学会総会で、癌研の馬場さんが話されたので既に御存知のことと思いますが、長期観察による発癌率には性差はないが、その過程では♂の方が早く死亡し、これはtestosteroneによって惹起されるものである。これを馬場さんは、発癌頻度に性差はなく、その後の育癌の過程がtestosteroneによって促進されるからと考えています。（しかし、発癌がtestosteroneやestradiolにindependentでるという積極的な実験的証拠はこの実験の中にはないようです）
　2)正常肝の代謝にもホルモンが影響する
(a)Cantarow,A.et al:Cancer Research 18 818(1958)
　Uracil-2-C14は正常rat肝ではRNAに入らないが予めtestosterone或いはgrowth Hormoneを投与しておくと再生肝同様RNAによく入る。
　(b)岩本：生化学 31 355(1959)
♀ratの肝細胞核のRNA代謝は♂より高く、摘出－補償実験によりestradiolは肝細胞核のRNA代謝を高め、testosteroneはこれを減ずる方向に作用することがわかった。
（３）発癌或いは担癌について生化学者は何を考えているか
　昨年12月のシンポジウム「発癌の生化学」でも討論されたように、肝のように再生能力の高いもの程癌化し易いようなことから、発癌の解明は即ちdifferentionの解明でるとして、発癌＝dedifferentionといった抽象的で現実から遊離した議論からみれば随分進んできています｡
しかし、分化ないし発癌を説明する理論としてJacob & MonodのRepression theoryを援用してmodelを組むわけですが、この理論はまだあくまで抽象的なもので、repressorの実体は全く不明で、現状では何を考えてもよいわけです。
　そこで内分泌学者の一部ではステロイドホルモンの作用機作を説明するためにsteroidをrepressorとして考え始めた人もあります（正確にはco-repressor或はco-deprepressorとすべきでしょうが）。確かに、このmodelでは、発癌まで含めて如何なる方向への細胞代謝の変化も説明はできます。
（４）当面どんな実験を考えているか
　rat liverの組織培養で、testosteroneやestradiolのようなsteroid hormoneが代謝にどう影響するかを例えばP32-incorporationなどで調べる。同時にDABを与えたらこれが如何に変動するか｡この組合せをいろいろcheckすることにより、DABの細胞増殖誘起に至る過程の代謝面での変化をつかめるまもしれないと思っています。
　ただ、生化学的後処理のために、今行われているのとは違った培養法をとらねばならないと思うので、現在想をねっています。腹案は一つありますが、後程御相談致します。

《伊藤報告》
　小生昨年末に父親を脳溢血で失い、其前後のごたごたの為最近迄研究室をすっかり離れてしまい、やりかけの仕事を途中で放棄したものもあり、誠に申訳けない次第ながら最近はすっかり停滞して居ます。そろそろ又もとに戻らなくてはと考えているところです。
　前回の連絡会の際に申し上げました様に、吾々の教室としては、今回新任教授に陣内先生をお迎えしました。昨年暮頃より各医局員の個人面接が行われて居り、小生も約一時間に亙ってお話をしました。それによりますと(1)従来のOncotrephinに関する仕事は4月頃までに何とかSchlufをつける。(2)発癌の仕事は続けてやって欲しい。(3)他に臨床に結びついた仕事を始める(人工内蔵or臓器移植)。と云った様な事で、何れにしても、此の研究班の班員としての仕事は続けてやって行けさうです。
　それで昨年度の小生の成果を振返ってみますと、甚だ情ない次第ながら、はっきりした点はラッテ肝細切→Trypsinizeと云う方法で或種の細胞を比較的多量に、従って早期に復元出来る程度の量を得る事が出来ると云う事だけでした。今后は此の細胞の撰択、及び発癌要因の追加と云う事に努力してみたいと考えて居ます。

編集後記

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