《勝田報告》
発癌実験：
前回の班会議のとき、RLC-2(正常ラッテ肝細胞)を長期間タンザクで傾斜静置培養したところ、5週間后にtransformed cellの発生を見出したことを報告したが、この細胞はその后も急速な増殖をつづけ､もはやRLC-2との共生ではなくなってしまったので､Rat liverHepatoma(?)の株ということで、RLH-1株と命名した。この細胞の性質及びその后の経過について報告する。
1)Transformed cell(RLH-1)の形態と生態
細胞の大きさはきわめて小型である。(写真を呈示)写真中央の細胞はいわば原型といえそうである。円形のものもある。シートの上にもどんどん円形のが積重なって行く。2核〜多核も非常に多い。分裂も、3極分裂は稀でなく認められ、4極もある。分裂直后fuseして多核になることも多い。顕微鏡映画を大分撮したので、次の班会議のとき展示したいと考えている。Gemeration timeは正確に未だ分析してないがかなり早い。
接種数を変えて(2種)その増殖曲線をとってみた(図を呈示・週42倍)。もっと接種数を減らせばこの増殖度は上昇すると思われる。
とにかく現在ふえすぎて継代の手間に困る状態である。継代状況をお目にかける(表を呈示)。ミステリーゾーンから来た生物のように増えつづけている｡
2)RLH-1細胞の染色体数
まだ25ケしか算えてないが、68本にピークがあるらしい(表を呈示)。Hypertriploidである。勿論もっとかぞえる予定であるが、本数の多いのは閉口である。思切り少い方へ変ってくれたらさぞ良いだろうと思うが・・・。
核型分析は土井田班員におねがいする予定であるが、ざっと見た感じでは､大型のmeta-centricが17〜20本もあることが目立つ。acrocentricは数ケである。それ以外のは小型のmetacentricやtelocentricの多い点ではRLC-1､C-2と似ている。metacentricだけが増えたという感じである。なお表で136本が１個あるが、これは2核細胞の同時分裂かも知れない。ごく相接した2groupsのようにもとれるからである。そうとすれば68本は11.5/25となる｡
3)RLH-1細胞の復元接種試験
これまで3種の復元法で試みてきたが､現在までのところでは未だ腫瘍形成を確認できていない。(1)1964-3-4:生后3日ラッテ2匹､左肩皮下､約20万個宛。(2)1964-3-15:生后35日ラッテ2匹､右大腿部筋内､約900万個宛。(3)1964-3-21:生后41日ラッテ2匹､腹腔内､1,250万個宛。脳内にも接種したいが、目下出産待ちである。(1)(2)ともまだ腫瘤を触れない。初代は一般にtumor formationがおそく、1〜2月かかった報告もあるので、ずっと永く経過を見守ることにしている。(3)は１日おきに腹水をとって塗抹標本を作っている。第2日は、培養内のRLH-1と同じようにbasophilieの強い細胞が沢山見られ、そのmitosisもあった。第4日になると腹水が血清をおび、赤血球も大分混じてきた。まだほとんどの細胞が、basophilieが弱くなり、mitosis数もずっと減少した。第6日には一層mitosisが減少した。腹水中に見られる単核(2核もときどきある)の細胞が、Host側の単球或は組織球であるのか、接種したRLH-1が新環境のなかでそのような形になったのか、よく判らない。前者とすると、RLH-1が余りに早く消えたことになるので、網膜、腸間膜などにひっかかって巣を作っている可能性もある。とにかくもう暫く経過を見守る他はなさそうである。
4)追試試験
同様の培養法で次々とExp.をstartしている。Nagisa作戦である。Exp.Noは#CNとした。#CN1は、この現象を見付けたときのExp.である。
EXp.#CN-1:RLC-2細胞→5w→RLH-1発生。
Exp.#CN-2:1964-2-25開始、3-17.subculture。RLC-1､RLC-2､RLC-3：平型回転管、各2本宛。この内RLC-2の１本は、タンザクだけ出して顕微鏡映画を撮った。Nagisa現象は何れも見られるが、新生細胞は未だ出現していない。
Exp.#CN-3:1964-3-4開始、RLC-1(平型2本)、RLC-2(TD-15､2ケ)、RLC-3(TD-15､1ケ)、
RLC-5(平型2本､TD-15､1ケ)何れも未だ新生細胞は現れていない｡
《佐藤報告》
発癌実験は培地中のDABの細胞当りの消耗を見ています。来月には復元其の他の結果も揃いますので班会議で報告させて頂きます。最近JTC-11の実験を纏めましたので、御参考までに報告いたします。(増殖率の図を呈示)。inoculumが少ない場合、計算上40個でも増殖して来ます。適性培地に関しては(図を呈示)、培養6日目の成績では､BSは20％､LHは0.4％､YEは0.04％､glucoseは0.36％が最高の増殖を示しています。JTC-11細胞のmaouse復元成績では､癌性は高く保持されている(図を呈示)｡
《杉 報告》
golden hamster kidneyのprimary culture−stilboestrolの系で、実験群に於いて対照群よりも細胞増殖がよく起り、しかもそれが特に上皮様細胞についていえるということと、この上皮様細胞の増殖には、薬剤を間歇的にくり返し与えることがいいのではないか、という結果が得られた。しかしrat liver−DAB系における程の顕著な増殖は、残念乍らまだ見られていない。
現在、更に加うべき刺戟について検討しているが、このsystemはあまり期待出来ないかも知れないという意見が前回の班会議で出たこともあり、ここでもう一度従来報ぜられている動物実験の成績を振返ってみたいと思う。
oestrogenic stimulationを長期に作用させていると、male golden hamsterのkidneyにrenal carcinomaを作るがfemaleは作らないという発見はKirkman and Baconによってなされ、この事はHorningによって確かめられている。
hormone投与によるmalignancyのiductionが内分泌系に属しないKidneyにおこるということは特異的である。潜伏期が稍長くて9〜12months(但しこれはtumourが外から触れて分る程大きくなるまで)という欠点があるが､興味あることはpelletを一回与えるだけでは発生率70〜80％であったのが第一回投与後3〜4monthsに第2回目のpelletを与えると100％に発生し､しかも出来たtumourは大きく､より容易に転移し易いということである。このことから我々の実験でも長期に連続して与えること、又は間歇的に繰返し与えることは必要であると思われる。発生したtumourはtransplantationが可能であるがそれはstilbeoestrolで前処理したmale hamsterに於いてのみ可能である｡即ちhormone dependantであるという。 tumourはcortical tubulesのepitheliumから発生し､medullaからは起らないと云われているが､Kirkmanはintertubular connective tissueがtumour発生に重要な役割を演じているかも知れないと述べている。又最も早期にはhyperplastic focusがあるが最後には明らかにcarcinomatousになると述べている｡そしてこのtumour発生はhormone antagonistであるtestosteronの同時投与によって予防される。他のrodentsは､oestrogenによりkidneyにtumourを作らないが、hamsterのkinney epitheliumだけが何故tumourを作るかということについては、Horningはhamsterのrenal epitheliumが吸収されたchemical carciogenにより選択的におかされ易いという他の実験結果を示している｡更に流血中のoestrogenを不活化するliverの能力に注目して､hamster liverは他のanimalのliverに比べてこの能力の弱いことを指摘している。又Shoppeeはoestrogenを過量に与えた場合、その10〜20％だけがmetabolitesとして尿に排泄されるに過ぎないと述べている。Stilboestrolが果してこのままの形でkidney cellに作用してtumourを作っているかどうかは、我々の実験の重要な
Key pointになるが、以上の考え方はstilboestrolをそのままの形で作用させている我々の実験にとっては都合がよいと思われる。しかし一方stilboestrolはhormone作用を有し、それによって出来たtumourがhormone dependantであるということから、tumourの発生にはhypophyseなどが関係していることが考えられるので、これらとの関連も考慮しなければならない。
我々の実験結果で、実験群に上皮様細胞の増殖がよいということは、動物実験におけるhyperplasieの段階に対比して考えてよいかも知れない。これから先の変化を起させるのが非常に難しいと思うが、長期に作用させ観察することはやはり絶対必要と考える。
hamsterの性による反応の違いについては、femaleは常に多量のoestrogenにさらされて或程度physiological adaptationが出来ているのに対してmaleではそれがないためであるという意見がある。
我々の実験ではまだhyperplasieの段階?であるため性による差異は認められていない。
《黒木報告》
Hamster Cheek Pouch内移植法の基礎的研究 ．異種新生児皮下移植法について
新生児特に生后24hrs.内の動物は異種を識別する能力をもっていないと云われています。Hamster Cheek Pouch内移植法と異種新生児移植法とを同一細胞を用いて比較すれば前者の特殊性を明瞭にし得るものと考えられます。
実験材料：
動物はC3Hmouse(C3H/HeS､C3H/HeN､C3Hf/HeN)、夫々、我々の研究室において、Brother-Sister-Matingにより純系化しつつあるものです。妊娠したマウスは、朝夕二回づつ観察し、生后24hrs.内に発見出来るようにします。又、吉田肉腫も仔発見后直ちに移植出来るように週2〜3回移植しておきます。皮下移植量は0.1〜0.05ml、0.05mlの方が細胞のもれが少くよいようです。(表を呈示)。表から分るように100万個から100個で100％腫瘍増殖を示します。しかし10万個の１例を除いて他は全てregressしてしまいました。(死亡例は移植后27日死亡)。10個移植群は目下観察中。脳内は組織標本作製中。
増殖の一例をActual sizeで表示します。10日から15日は、皮膚及びBodenに癒着､動かない､Tumorは硬い。27日よく動く､軟い､内容物は白色､粥状のもの。43日(-)｡
《山田報告》
コロニーの大きさによる細胞増殖度の差異：
ヒト2倍体性細胞株の増殖度の衰退は、決して継代40代後にはじめておこるのでなく、若い継代においても増殖能の喪失という形であらわれることを前に報告しましたが、その実証として次の実験を行いました。シャーレ内に収めたカバーグラスの上に少数の細胞を播いて増殖させた後(7日間)、培養液にH3-thymidineを加え、一世代時間以上(48時間)培養してオートラジオグラフィーにかけて、DNA合成を行なっている細胞の頻度を測定した。このラベル細胞の頻度をコロニー(クローン)構成細胞数によって群別して比較すると、少数の細胞からなるクローンはラベルされる細胞が少ないことが認められました。すなわち大部分の細胞の世代時間が48時間以上と考えられる。コロニーが大きくなるにつれて、ラベルされた細胞の頻度が上昇し、80％近くで、そのカーブはわるくなっている。このことは、100個以上まで増殖した細胞コロニーでも、次の48時間にDNA合成に入れない細胞が20％出現してくることを意味しています。したがって細胞が新生されたときに20％前後の確立で細胞が増殖し得なくなり、ただ生存するようになると考えると、この種の非増殖細胞の頻度が次第に大きくなってくることがよく理解されます。そして継代によるコロニー形成率の低下、および対数増殖期における増殖度が一定なことなど、これまで得られたデータを説明することができます。
マウス腎、肺組織の2倍体性細胞株：
すでに成熟マウス、生後１日、および胎児について、その継代培養、染色体変化の有無、およびNitromin耐性に関する研究を行なっています。とくに動物に対する移植性を、マウス脳内接種で追求中、正常の胎児のトリプシン消化細胞の移植性、50日継代腎細胞株の移植性を観察中です。
《伊藤報告》
前回の報告会で申上げました如く､今后暫くは何とかしてhomogenizerを使って得た細胞をconstantに培養し得る条件を決めるべく､その基礎条件を検討し度いと考えて居ります。今迄に得られた結果
［肝の潅流及びhomogenizeの検討］
◇動物は原則として生后20〜25日目の“ドンリュー”を用いた。
◇潅流液：Sodium Citrate(0.027M)in calcium free Lock's Solution
◇判定：Tripan blue染色により、生細胞の残存率をみる。潅流液量を15mlとした場合､stroke回数10回で約5％､20回では１％以下。潅流液量30mlとした場合では､stroke回数10回で約4％､20回では１％以下。
まだ検討回数が少く確実な事は云えませんが、予想された如く、潅流液の量は余り問題にはならず、Homogenizerによるstrokeの回数に影響される点が多いようです。
また、10回のstrokeで充分細胞はバラバラになって居る事からして、今后更に少数回のstrokeでの検討を要します。
前回の報告会での山田先生の御報告、又Sacksの文献(此れのDataそのもの､或はその判定には尚検討を要すべき沢山の問題があると思いますが)等から考えて、homogenizerを使って得た細胞について実験をすすめて行く場合、更にはMass Cultureした細胞に発癌剤を与えてtransformさせる場合、transformされるものは恐らく極く少数のものでせうし、その少数のtransformed cellをcheckするのには、platingが非常にすぐれた方法である事を痛感させられました。是非やってみたいと考えて居ます。
《安村報告》
１．果糖肉腫(FRUKTOyl)の浮遊培養のこころみ
1-1 Genetic transformationをてがける最初の段階として、細胞を大量に培養できることがのぞましい。それによって細胞DNAを大量にとりだすことが可能になるからです。
1-2．本番の浮遊培養は、Eagle合成培地適応株（FRUKTOEg：現在は、Eagle's minimum essential medium･1959＋Biotin 0.25mg/lの培地でかわれています。いまのところBiotinをのぞくと継代できません。抗生物質ははいっておりません。P.R.はいれてあります。)予備実験としてFRUKTOyl株−YLEだけでかわれている−をつかいました。
1-3．このFRUKTOyl細胞はガラスにわりあいよくつくのを撰択してできたものですが、もちろんピペット操作だけでかんたんにガラスからはがれます。この細胞をYLEだけで在来のスターラーでマグネチックバーをステンレスワイヤーで宙づりにしてカクハンしますと細胞は死滅してゆくばかりでした。
1-4．そこでMcLimansやMerchantたちによって開拓された、メチルセルローズ(和光･CPS4000)をつかってみました。DOWChemicalのは手にはいりませんでした。なおカルボキシメチルセルローズはよくありませんでした。濃度は0.1％と0.2％です。結果は(図を呈示)、生存はある程度維持できましたが、結局は増殖がみられず失敗におわったわけです。生細胞数は前号(6403)にあるようにErythrosinBで染めてしらべました。
1-5．メチルセルローズが0.1％以下、たとえば0.02％､0.04％では0％同様に細胞は死滅する一方で、2日目には全滅というぐあいです。培地はメチルセルローズをくわえて高圧滅菌します。
1-6-1．在来のスターラーでは正確な廻転数がわからず、文献の記載に従ってslightly convexedの水面をめやすにしてやっているわけです。夜中の電圧上昇によって回転が早くなることによって細胞の損傷がますことも考えられます。
1-6-2．バーをつるのにステンレスワイヤーをつかいますが、その上にswivelとして釣道具屋さんから｢ヨリモドシ｣と称するものを買ってきてつかいました。ステンレスというはなしでしたが、これはマッカなウソで真チュウにクロームメッキしたものでした。１カ月近く回転していましたら、ロクショウがでてしまいました。
1-6-3．このswivelをテフロンで試作をたのんでいますが､加工がむずかしいといってまだできません。ステンレスは加工がなお困難です。スターラは１分間60回転のモータで試作できました(電圧の影響をうけません)がこれでは細胞が完全に浮遊状態にならないので、もう少し早いのを試作中です。試作は三陽理科器械製作所(千代田区神田鍛冶町1-2)です。その他(図を呈示)目もりつきの300ml容量の培養びんも同所でつくってもらいました｡瓶の下の口からはダブル栓をとおして注射器で液を採取して細胞数をかぞえることができます。 ２．SV40による腫瘍からの細胞の培養
2-1．培養細胞の3代目を新生児(24時間)ハムスターに皮下に14万個１ぴき、7万個2ひき接種しました。18日めごろよりアズキ大の腫瘍をふれるようになり、現在では直径5cm以上の大きさになりました。うち１ぴきは40日め(接種後)に死亡しました。
３．そのほか(ウメクサ)
3-1 細胞保存の文献：Persidsky,M. & Richard,V.:Optimal coditions and Comparativeeffectiveness of dimethyl sulfoxide and polyvinylpyrrhoridon in preservation of bone marrow.Nature 197(4871):1010-1012,1963.(培養細胞ではありませんが､役に立つと思います｡)
《奥村報告》
昭和38年度は、諸々の観点から考えて一班員としての義務を遂行する自信をもてず脱班させていただいたのですが、本年4月から再び入班して皆様と一緒に発癌研究をする事になりましたので宜しくお願い致します。予研に移って3年目を迎え、どうやら昨年暮頃より落着いて仕事をする場を得、この4月１杯ぐらいで略設備の方が一段落という見通しが出来ました。本年は大いにピッチを上げる心算です。現在までは新設部のためと検定業務のために雑役などにかなりエネルギーを取られてきましたが、今年からはあまり悩まされずに済みそうです。
ここ2年間は主に“各種実験動物の各臓器由来細胞の初代並びに初期培養の条件"を行い、同時に初代又は初期培養細胞の少数細胞の培養条件を検討してきました。私は一昨年の頃から班会議でも話しましたが、ヒト羊膜の上皮性と繊維芽性細胞の分離培養(初代から)を始めて以来、種々の材料について分離培養を試み、又考え続けてきましたが、最近どうやらCO2フラン器(約１年間かかって作り上げたもの)を巧みに利用することによって初代培養から細胞の分離と又少数細胞を略確実に培養することができる様になってきました。その１つがウサギ子宮内膜細胞で、本年は子宮内膜に関しては、現在の培養方法を礎にして種々の実験を行いたいと考えています。
ウサギの子宮内膜を用いる主な理由として、(1)内分泌系細胞のうちで子宮内膜が発癌実験をし易いと考えた(いづれはヒト､ハムスターなどからの子宮内膜細胞を用いたい)。(2)ウサギには他の動物の様に週期的排卵がみられない､つまり子宮内膜細胞が時期的に著しい変化をしないために多数の細胞を得るために何匹ものウサギからとった細胞をpoolできる。(3)ウサギの場合は１匹からでも15〜20万個の内膜上皮細胞を採取できる。(ラットは1〜5万個のviable cell)。したがって同一個体からの細胞で種々の実験を可能にする｡
培養方法：
(1)トリプシン消化は0.25％(NBC 1:300)のトリプシン液で30〜40分
(2)用いるmediumは199(NaHCO3 0.11％)にcalf serum(Lot番号C)20％に添加したもの
(3)容器はシャーレ(細胞浮游液1ml､2mlを入れる2種類)
(4)細胞濃度:約5,000､10,000､30,000､50,000(いづれもper dish)
(5)送り込むCO2:培養開始2〜3日間は8〜10％CO2ガスを含む空気、基質5〜6％CO2含有空気中に移す。
培養結果及びホルモン投与実験の結果は次号に記載します。
編集後記
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