【勝田班月報・6603】
《勝田報告》
　Ａ）DAB-amine-N-oxideについて：
　前月号にこのDAB-N-oxideが実に不安定であることを報告しましたが、それは培地中のヘモグロビン､特にFeがcatalystになって、MABやDABに変ってしまう為と、寺山氏から聞かされていました。そこで血清蛋白のpureなものと一緒にすれば、それと結合して安定化するのではないかと考え、ArmourのBovine albuminの結晶(FractionV)を再蒸留水にとかし､それにDAN-N-oxide 10％溶液を等量すなわち終量5％になるように加えた。これを37℃で20分間incubateした后、約6時間室温に保存した后、分光光度計で吸収をしらべた。対照としてalbuminと混ぜないN-oxideの5％再蒸留水溶液を作り、同じような処理をした后、吸光度をしらべたが、対照の方は低いピークではあるが320mμに鈍い山を示し、N-oxideの存在することをあらわすと共に410mμに山がなくDABはほとんど含まれていないことを示していたが、前者のalbuminと混ぜた方は、280mμのproteinの吸収から急速に下降し、少しは肩は示すが、320mμにはピークは消失し、その代り410mμにピークができて、DABに変ったことを示した。
　そこでこんどはDAB-N-oxideの20μg/ml再蒸留水液3mlと、FractionVの１％再蒸留水溶液１mlとを室温で混じ、BlankにはFractionV１％液１mlと再蒸留水3mlを入れ、その吸光度の320mμにおける経時的変化を連続的にしらべたところ、0→100までの吸光度の目盛で、10分間に１目盛宛continuouslyに吸光度が落ちて行くことが判った。
　これらの所見は、DAB-N-oxideがきわめて不安定なことを示して居ると共に、寺山氏がN-oxideを動物に呑ませて肝癌を作った場合にも、体内の血中でN-oxideはDABに変り、DABが肝癌を作っていたことを示唆している。つまり寺山氏が[N-oxideの作用と思ったのは、実はDABそのものの作用であった]という可能性が大きい。
　しかしごく短時間に細胞内の物質と結合して作用をはじめる可能性もあるので、RLC-9株(正常ラッテ肝)を使い、DAB-N-oxideの濃度を次第に上げながら連続的に与えておく実験もおこなっており、現在30μg/mlと40μg/mlの2群がある。
　Ｂ）Nitrosodiethylamine(DEN､Tokyo-kasei)･(C2H5)2N-NO･(M.W.:102.14)について：
　ラッテ肝細胞株に長期投与しているが、映画でしらべるとどうも細胞増殖が反って促進されている感じなので、cell countingをやってみたら次のような結果が出ました。
　(表を呈示)細胞：RLC-9株､RLC-10株。Culture medium:20％CS＋LD。 addition of CEN:From the 2nd day。添加濃度：1〜80μg/ml。細胞はどちらも正常ラッテ肝由来ですが、反応に少し差があるようです。RLC-10では80μg/mlが添加7日后にmax.になってしまいましたので、今后さらに高濃度をしらべてみます。
　Ｃ）DABによるラッテ肝細胞の増殖誘導：
　前にやったことですが、らってが純系になったので、2月18日、F25♀生后10日のラッテの肝を使い､DABを１μg/mlに第0日→第4日だけ用いたところ、第14日にExp.:8/8。Cont.:5/6に増殖を得た。これらは今后DENの実験に用いる予定です。

《佐藤報告》
　皆さんに対して研究の責任を感じていますが、思う様にはかどりません。正常ラッテ肝の培養(Primary)から実験に使用できる細胞が未だできません。従って今月は月報を遠慮した方がよいかとも思ったのですが、現在までの進行状況を書き送ります。
　C163 11-19=0日　生后6日♂。現在96日、もうすぐ使用できると思います。
　N.7　1-19=0日　生后5日♂。本日継代した所ですので未だよく分りません。染色体標本とギムザ標本をつくるようにしました。
　上記2例以外に、Primary cultureしていますが、未だ継代していません。実験にBovineSerumとCalf serumのロットを各々2本使用しましたが、増殖はBovine Serumの方がよい様です。
　◇難波君は主として免疫と、培養肝細胞のBilirubin代謝に主力をおいて毎日やっていますが、未だ充分の結果がでません。

《黒木報告》
　2月はハムスターの出産がなく、4NQO関係の実験は進行していません。
　目下feeder layerの為にMouse embryoのcultureをしています。出来るだけ多くcultureしcell batchとして凍結する積りです。又､ハムスターも生れたときに出来るだけ培養し、凍結保存し、以后必要の際にとり出す方針です。
　そこで凍結のためのいくつかの予備実験をしましたので、御参考のために記します。凍結温度は液体空気-196℃、容器はLinde LR10-6型、硬質ガラス特製アンプレ使用。
　(1)DMSOとグリセリンの比較及び凍結方法：
　L1210(マウスの腹水型白血病)使用。凍結期間60日(表を呈示)。-80℃の温度は大西製のfreezerによる。凍結後の腫瘍性確認のための移植はCDF1マウスへ生細胞を1万個i.p.移植。生死判別は0.25％のtripan blue染色。
以上の実験から、1)DMSOの方がGlycerolよりもはるかによいこと。2)凍結の方法が重要であること､-80℃に入れる方がよい(3時間)｡それから液体空気に入れる。
　(2)DMSOの濃度の検討：
　上の実験の凍結方法3､すなはち､＋4℃ 2hrs.-80℃ 3hrs.。次に液体空気に入れる方法により、DMSOの濃度の決定を行いました。細胞は吉田肉腫、凍結期間は4日、細胞浮遊液は10％Bov.Ser.､EagleMEM、生死判定はtrypan blue。
　(表を呈示)。0％の41.8％の生細胞という成績はsmearを作ってみた結果、ほとんどが裸核のことがわかりました。すなはち、細胞質が非常にもろくsmearのときにこわれたものと思はれます。(DMSOもグリセリンも添加せずに凍結-40℃可能というhauschka T.S,Levan,Aの論文があります｡)　以上の結果から、90％以上の生存率で、安心して−停電断水の心配なしに−凍結することが出来ることが分り、目下実用に入ったところです。
　寒天培地内におけるコロニーの形成について：
　寒天内のコロニーの切片標本が出来ましたのでその形態について記します｡固定はBouinです。これを用いると寒天が固るので以后の操作がしやすくなります。
　(表を呈示)Invasion(+++)は､倒立顕微鏡又は切片で細胞が寒天の中に入りこんでいくもの､Invasion(-)は細胞が塊をなし外に出ていこうとしないものです。(+++)には､YoshidaS､PolyploidYS､AH13､AH13M､AH13C､AH7974F､AH66F､AH130F(Si)､AH130F(G)､AH131B､ CulturedYSがあります。AH39､AH423､HeLaは(-)でした。自由細胞率との間の相関に御注目下さい。Invasionと云うよりは運動能かも知れませんが｡

《高木報告》
　その后も人胎児組織をPlasma clot methodで培養しています。
　１）人胎児皮膚の器官培養
　約6ケ月と思われる人胎児の背部より皮膚を切り取りP.C.200u/ml､S.M.200μg/mlを夫々含むHanks液に１時間宛3回液を換えて浸した後、6x7mm程度の切片を作る。Plasm clot作製法は前報のものと全く同じでシリコンコート注射器による採血も大分うまく行くようになった。実験群はC.E.E.に入れた4NQOが10-5乗Molの最終濃度になる群と、何も入れない対照群とを置き、夫々4､8､12､17日目にBouin固定､H & E染色にて観察し、対照群のみ21日まで培養した。
　培養後の変化として両群共にこれまで種々の培養法において等しく認められた様に角質層の増生が起り、経日的にその程度が増すと共にParakeratosisを認めたが両群間に有意差はなかった。
　同様に培養前2〜3層であった表皮層も経日的に厚さを増し、12日目のものでは両群共に6〜7層と可成り厚くなったが､両群とも同様で特に対照群の皮膚組織は3週間殆んど謙常に保たれたと云てよいと思う。また培養前の組織には全く認められなかったMitosisの像が、培養4日目のものに両群共可成り多数認められるようになり、この傾向は12日目までほとんど同程度に継続されたが、17日目のものでは4NQO添加群の組織で核が急にややPicnoticになりMitosisを全く認めなくなった。
　この変化が4NQOの影響によるものか、もっと他のfactorによるものかは今後の検討を要するところです｡対照群は21日目まで培養を続けたが17日目のものと殆んど同様にMitosisが認められた。12日目までのものに見られたMitosisの数量的な差については､4NQO添加群の方が幾分多いのではないかとの感じをうけるが､確定的なことは云えない(写真を呈示)｡　２）人胎児腎の器官培養
前の腎組織培養に引続き今回はPlasma clot method及び液体培地(70％199､20％BS､10％C.E.E.)の比較を行うと同時に相方共に4NQO 10-5乗Mol添加群と対照群をおいて培養した｡　用いた腎組織は約6ケ月の人胎児より得たもので、摘出后P.C.100u/ml､S.M.100μg/mlを含むHanks液に約3時間浸した後、4x5x3mm程度に細切し、前報同様のPlasma clot上及び、Stainless meshにより、培地に接するようにした液体培地により培養した。その結果は、Plasma clotによるものでは対照群は１月号に写真を載せたものとほとんど同程度であり、4NQO添加群では培養后8日目頃からcentral nectosisと共に全体的に核のPicnosisが目立ち、この傾向は経日的に増強して17日目のものでは組織の大部分はnecrosisの像を呈しており、4NQO群は培養を打切った。対照群は引続き27日目まで培養したが、27日目のものにも前報､写真､培養22日目の人胎児腎と同程度に可成りよくorganizeされており、一部にはglomerulusの構造も認められる。液体培地を用いたものでは、夫々対応するPlasma clot cultureに比べて培養後8日目より全体的に核のPicnosisが強く組織固有の構造がほとんど認められなくなる。この傾向は矢張り4NQO添加群に強く12日目のものでは両者ともに、殆んどの核がPicnosisを呈する。しかしいずれの実験群においても培養前、培養後の全期間を通じてMitosisは認められず、又、4NQO添加に対する反応と思われる何らの所見も得られなかった。液体培地については血清濃度などに今後検討すべき問題点があると思う。

《高井報告》
　今月は公私共に雑用が極めて多く、実験の方が殆ど進まず困っています。
　１）bE11Ac.群のその後の経過：
　前月報に報告した様に、小型紡錘形の細胞が殆どを占める様になった後、かなり細胞数が減少して来たので、2月7日(培養44日､Ac処理35日間)からアクチノマイシンを含まない培地に変更してみました。Ac(-)にしてから約１週間で細胞はかなり回復し、cell sheetを形成して来ましたが、同時に細胞の形態も対照群と酷似したものになりました。
　要するに、この群の細胞に見られた形態学的変化は、まだ可逆性であったわけで、いわゆるtransformationはまだおこっていないと考えらると思います。この群のcellは、もう一度アクチノマイシンを作用させてみるつもりです。
　２）ASSV(in vivo固型アクチノマイシン肉腫のprimary culture)：
　前回の班会議で勝田先生から指摘されました､in vivoのアクチノマイシン肉腫細胞の培養条件の検討にとりかかりました。今回はprimaryのtumorがありませんでしたので、btkマウスで継代せる腫瘍(前月報の実験の100個移植群のNo.1のマウス)を材料としました。培地は20％CS･YLHと20％BS･199の2種とし、細胞数の測定でなく、顕微鏡による観察のみにしました。現在１週間目ですが､20％CS･YLHの方はかなり細胞の変性が強く､20％･BS199の方が(やはり変性の傾向はありますが)細胞は少しキレイな様です。
　３）btkマウスについて：
　先日の班会議でbtkマウスについて､御質問がありましたので、ここにあらためて記載します。余り詳しい文献は見当らないのですが、「アクチノマイシンの発癌性に関する研究。I.アクチノマイシン皮下注射によるハツカネズミにおける肉腫発生実験」中林登：大阪大学医学雑誌11(7)､1959、の中に次の様に記載されております。すなわち「･･･btk系とは、C57BL系ハツカネズミ雄と、螺良､赤松らによって分離された乳癌好発系ハツカネズミtaの雌を交配し、そのF1からC57BL系ハツカネズミに似た黒色の毛色を選別して兄妹交配を行い、現在第15代に到っているもので･･･」とあります。前月報のDiscussionの項の私の答えを上記の如く訂正させて頂きます。

《奥村報告》
　Ａ．ウサギ子宮内膜細胞に関する研究
　前月報(班会議)で報告した結果以上のものは未だデータとして得ておりませんが、オートラジオグラフィーでホルモンの細胞内への取り込み実験がある程度可能であることが判明したのでその后の確認実験を近いうちにするつもりです。その具体的計画について若干述べてみます。
　用いる細胞：ウサギ子宮内膜､ヒト子宮内膜､その非感受性と思われる1〜2の細胞(現在考えているものは“in vitro"cell lineとnon-target cellのprimary culture)。
　ホルモン：Progesterone､Estradiol､TeststeroneとこれらのH3ラベルしたもの。
　培養条件：CO2及びO2gasの量を調節できるincubatorを用い、少数細胞(500〜1000/ml)をplatingし､コロニーレベルで行う。optim.pHは現在まで得られたデータから7.4〜8.0の範囲を用いる。serumは仔牛とヒトのものを用いる。synthetic mediumはNo.199とEagle'sbasal medium､F-10､他に特別のconditioned mediumを用いる。
　以上の実験を再開するに先立ち、予備実験として生化学関係の人と共同で37℃で種々の培地条件(例えば､血清入り培地､又は各細胞のあるフラクションの添加された状態)での各種ホルモンのstabilityを時間に追ってしらべる計画を立てている。
　ウサギに比べてヒト子宮からの細胞採取はいろいろな点から困難であって、実験条件を十分検討しなければならないと思う(age､その他)。材料については最近ある病院から手術材料として子宮全部(傷つけずに)をまるごと入手出来る様に話がついたので大いに助かります。おそらく来月ぐらいから月に一度ぐらいはもらえると期待しております。
　Ｂ．JTC-4細胞のDNA、染色体に関する研究
　前号までに数回にわたりJTC-4のchromosome complement及びDNA contentについて報告しました。その結果、この細胞のDNA contentがdiploid cell(大部分はG1 phaseにあると考えられているもの)より少く､haploid量(sperm)より多いことがほぼ確かであろうということが判った。さらに、来月(3月)から伝研の積田教授に入門してDNAのbase compositionをしらべることにした。その方法については先日､積田先生と話し合いましたが、当面2つの方法を用いることになる様です(詳細は省略)。
　いづれにしても、“in vitro"cellとしての非常に好材料として考えている、この細胞のcharacterizationを主眼にし､その中からspecificでstabilityの高いmarkerを見出して行こうと計画しております。予備的実験としてはcollagen formation ability､LDH isozymepatternなど2〜3のものを、その専門家に依頼して結果は出ております。またauto-immuneとGuinea pigのheteroのsystemの両方で、immunologicalな実験の材料作りをはじめてもいます。
　Ｃ．発癌の研究班に入って直接の発癌実験をすることが出来ず残念に思います。内分泌学的研究という“大げさな"課題に取り組んですぐ発癌の仕事というのは私自身の能力から考えて非常に無理なことであることに気がついた次第です。私はホルモンを扱うにしてもやはりBiological problem(ホルモンと細胞増殖､ホルモンと細胞の形質の関連性など)についつい魅惑されてしまって“ともかく何とか発癌を！"という一本のレールに乗れない様に思いました。しかし､今后もう少し生物学的課題の整理がついたら､そのレールに乗かることも可能かと思いますので、その時はどうぞよろしく御教示下さい。私にとっては現在発癌を実験的に行い、かつ生物学的課題をも併せて解析出来るのはウィルス−細胞というsystemが最も手がけやすいように思います。ですからしばらくは発癌に関しては､sponta-neous transformationか、ウィルス−細胞という系で追ってみたいと思います。それにつけても極度の人手不足で参りました。皆様の御発展をお祈りします!!。

《堀　報告》
　組織培養による発癌機構の組織化学的研究
　主たる目的としたことは肝組織片の培養によって得られる細胞群が組織化学的にどの程度肝細胞としての特徴を保持しているかを調査することであった。
　(1)Primary culture(1〜2wks)でacid phosphataseの活性と分布を調べた。
　APaseはin vitroではbile canalの両側に沿ってきれいな分布を示す顆粒に検出される。この様な特異的細胞内分布を示すのは肝細胞以外にない。従ってこれをmarkerとして実質細胞を区別せんと試みた。
MTK 　､吉田､武田肉腫､GTD､H-96､HeLa､H-99培養株を比較のため用いた｡
　確立された移植癌または培養株細胞においては、主としてnuclear hofにAPase顆粒が局在しているが、肝培養細胞では、in vivoにおける如きpericytoplasmな配列を示すものが多く見られた。しかし乍ら、このことは全細胞に共通したことではなく、このAPase顆粒のみによる細胞の分類､同定は不可能であった。
　(2)同じくG6PaseとPhosphorylaseの活性について。
　この2つのglycogenolytic enzymesは肝細胞を特徴付けるに充分な肝実質細胞に特異的酵素と考えられるが、そのいずれも培養細胞では検出不可能であった。
　(3)培養初期の組織片の変化。
　G6PaseとPhosphorylaseの検出が不能であったことから、培養初期の組織片の変化を調べることにした。
　培養開始から､時間を追って組織片を取り出し切片として､G6P､phosphorylase､glycogen､RNA､succinic dehydrogenaseの染色を行い、各々の消長を調べた。その結果、RNAやSDHは培養時間と関係なく、或いは次第に強く検出されるにも拘らず、glycogen､phosphorylaseは急激に減少、G6Paseも１日以上では検出不可能になることが判明した。
　(4)CO2incubatorでの組織片の変化。
　G6PaseやPhosphorylase､glycogenなどが何故この様に急激に検出不能になるかを更に調べるために、肝組織片を(1)培養液を用いず(2)LD-20にinsulin､Phlorizin､cortisoneを添加した培地と共に培養、2〜8hrs.後の組織変化を調査した。その結果、培地なしで只放置した組織片で一番酵素活性の消失が遅いことが分った。一方、添加物の効果は全く認められなかった。
　(5)酵素のin vitro inductionの試み。
　in vivoではcortisoneが肝G6Paseのinduceを結果することが分っているので、培養細胞にcortisone(1μg/ml)を1〜7日作用させてG6Paseの染色を試みたが不成功に終った。
　また、in vivoでは30％casein食により肝G6PDHのinductionが可能であるが、その培養えの適用は不能である。
　(6)G6PDHisozymeについて。
　培養肝細胞はin vivo肝より強いG6PDH活性を示す事が染色で判った。これはin vitroにおける酵素活性の上昇の唯一の例であった。そのため、電気泳動を用いて、正常肝、30％casein食投与肝、培養肝細胞のisozyme patternを調べることを計画した。
　正常肝では5〜6bands、30％casein食肝で6〜7bandsのzymogramが得られ、前者は後者の3〜4番目のbandに相当するものが極めて活性が弱く、5〜6番目が欠けていることが判明した。しかし乍ら培養肝では材料の不足のため満足なzymogramが得られなかった。
　培養肝細胞のzymogramが正常肝と異るとすれば、肝細胞の代謝の変化が示されることになり、興味のあることと思われる。

編集後記

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