【勝田班月報：６８０６：4NQOのphotodynamic action】

　
1. ラッテ肝細胞の増殖期による4NQOの感受性の相違：

   　これまでの実験で、どうもその都度、都度で4NQOの細胞に対する影響にむらがあるように思われたので、RLC-10株(正常ラッテ肝細胞)を使って増殖のいろいろな時期に4NQOを添加し、その増殖に対する影響をcell countingでしらべた。

   　結果は（増殖曲線の図を呈示）、増殖のstageによって細胞のresponseがかなり違うことが判った。しかしこれは、他の実験からも判ったことであるが、細胞のstageというより、むしろ細胞数/tubeの影響が大きいのではないかと推測される。

   　

2. 4NQOのphotodynamic action：

   　前月号の月報に記したが、癌センターの永田氏が4NQOのphotodynamic actionについて報告している。我々も顕微鏡映画で観察していて、どうもそれに一致するようなデータを色々と得たので、果してそれが本当かどうか、cell countingで定量的にしらべてみた。細胞はRLC-10株(正常ラッテ肝)で、4NQOで37℃、3.3x10-6乗Ｍ(その他の濃度もみたが)、30分間処理後すぐに365mμのマナスル･ランプで、室温で２時間照射し、増殖に対する影響をしらべた。No.6709の月報に報告したように、4NQOの特異吸収は366mμと252mμにあるので、この波長は正しいと思う。

   　（結果の図を呈示）おどろいたことに、正にphotodynamic actionを4NQOの持っていることが確認された。 　光だけを各種時間に照射したcontrolsははっきりとした増殖抑制は認められない。ところが4NQOで30分間処理した直後に光をあてると、照射時間の長さに比例してはっきりと細胞の破壊が起った。

   　同様の実験を、種々の濃度の4NQOについておこなった結果、やはり4NQOの濃度の高いほど細胞障害は強く現われた。

   　このようなphotodynamic actionがどんな意味をもっているか、ということであるが、永田氏はphotonによって4NQOにfree radicalができて、それが細胞のDNAに破壊的に働く、と考えているようである。しかしそのようなDNA levelでの障害が直接発癌に結びつくかどうか、私は疑問に思っている。photodynamic actionは発癌作用とは関係のない、副次的な現象であるかも知れないし、あるいはきわめて重要な役割をしているのかも知れない。これは今後解明すべき問題である。

   　H3･4NQOを培地に入れると、4NQOは細胞内の色々な成分と結合するが、とくに蛋白との結合量は大きい。Biochemistsはすぐに核酸の方を考えたがるが、この場合、蛋白、とくにlysosomal enzymesとの関連などについてしらべることは大変面白いのではないかと、私は思っている。そして4NQOの解毒をする酵素の誘導も大いにしらべてみたいと思っている。

《安藤報告》

　
1. L･P3細胞の場合：

   　実験方法は月報No.6801に勝田先生が書かれている方法と基本的には同じです。即ちL･P3細胞を培地DM-120中TD-40で約500万個/bottle迄生やし、これにH3-4NQO(がんセンター川添氏より分与)10-3乗Ｍ in 10％DMSO液を0.1ml/10ml培地/TD-40添加し、終濃度10-5乗Ｍとする。直ちに培養ビンは出来る限り遮光し37℃静置培養する。

   その後、時間を追ってサンプリングし、培地を捨て、Ｄで一回洗う。

   　細胞を少量のＤに懸濁し、酸不溶性分劃(核酸、蛋白が主成分)と酸可溶性分劃に分けカウントする。

   　結果及び考察：（図を呈示）

   　
   1. 酸不溶性分劃への取込みは30分で止り、その後２時間迄不変のようだ。５時間目の点が下っているのは、本質的なものか実験のエラーか不明。 　
   2. ５時間目に培地中よりH3-4NQOを除くと、この不溶性分劃のラベルは再び放出されるようだ。この部分が核酸についていたものか、それとも蛋白についていたものか定めるべきだろう。 　
   3. 月報No.6804に堀川さんが記しておられるように、酸可溶性分劃への取込は非常に特異的である。即ち30分あるいはそれ以前に最大値に達し、以後、培地中に多量存在するにもかかわらず、細胞外に放出されてしまう。毒物に対する細胞の防衛機構を如実に見せられた思いである。L･P3は4NQOに対し次に調べた正常ラット肝細胞よりもより抵抗性が強いので、そのためにこのような再放出の現象があるかと思って、RLC-10についても同様な実験を行ってみた。（図を呈示）図にある通り全く同じ結果となった。
   　
2. RLC-10細胞の場合：

   　4NQOに対する感受性の、より強いラッテ正常肝細胞の場合に於て異なる結果を期待したが、酸不溶性分劃への取込みも、酸可溶性分劃への取込みも、全くL･P3の場合と同じであった。但し使用培地はLDにCS･20％添加したものであり、H3-4NQOの濃度は3.3x10-6乗Ｍであった。

   　

3. L･P3細胞の核酸、蛋白質分劃への取込み：

   　L･P3を前記条件で２時間H3-4NQO処理を行い、直ちに細胞分劃を行い、核酸分劃と蛋白分劃に分けてみた。

   　       分劃　　　　　DPM/1,100万個cells　　％分布
   　     細胞全体　　　　　　170,450　　　　　  　　100
   　　酸不溶性分劃　　　　    8,615　　　　　　　    　6.4
   　　酸可溶性分劃　　　   125,910　　　　　　       93.6
   　酸不溶性分劃の内　　　　　　　　　　　　        100
   　　   核酸分劃　　　　　　   2,620　　　　　　　    23.8
   　　   蛋白分劃　　　　　　   8,520　　　　　         76.2
   

   　上記の表のような結果になった。今後の方針として、更に核酸分劃のRNA、DNAを分け、各々いかなる塩基と結合しているか、又蛋白部分についても、いかなる種類の蛋白に結合しているか、等を検索する予定である。

：質疑応答：

［安藤］等張液でさっと一回洗うだけです。

［高木］4NQOの濃度はどの位ですか。

［安藤］L･P3は10-5乗Ｍ、RLC-10は3.3x10-6乗Ｍが終濃度です。

[堀川］細胞当りの取込み量は、L･P3とRLC-10でちがいますか。

［安藤］ほぼ同じ位です。

［堀川］私の実験でも酸可溶性分劃のcountが短時間で最高値に達し、それからすぐにすっと下がってしまうのは何故でしょうか。

［黒木］10-5乗Ｍで５時間も添加していると、細胞が死んでしまいませんか。

［勝田］L･P3は4NQOに対してすごく強い細胞系で、５時間位では平気です。それにRLC-10にしても映画での観察によれば、死に始めるのは５時間よりずっとたってからですね。むしろ、そういうことより細胞側の解毒作用というか、4NQO分解酵素の活性がinduceされて、その結果として酸可溶性分劃のcountが急激におちるとは考えられませんか。

［梅田］若しそうだとすると、５時間後に又4NQOを添加してももう受付ないという現象が起るはずですね。 ［安藤］それは面白い考えだと思います。早速やってみましょう。

［勝田］私もその考えは面白いと思いますね。しかし、培地中に4NQOが一杯あるというのにその取り込みにピークがあり、急激な減少があるというのは又面白いことですね。

それから、うすい濃度でL･P3の増殖を促進するのですが、その時4NQOが細胞のどの分劃に取り込まれているかということにも興味があります。安藤君は核酸を追いたいというだろうが、私はむしろ蛋白の方に問題があると思い、蛋白を追え！と言っています。

［堀川］始の報告のphotodynamic actionについてですが、その機構はまだよくわかっていないのですね。

［勝田］癌センターの永田氏の話では、4NQOの誘導体の殆どが、発癌性とphotodynamic actionが平行していますが、4HAQOだけが例外で、発癌性は高いのにphotodynamic actionはないということです。

［佐藤］しかし動物の体内での発癌を考える時、photodynamic actionなんで考えられないと思いますが。

［勝田］そうですね。そう考えると培養での4NQO発癌実験も光を与えてどうなるかより、真暗な中で培養するべきだということになりますね。実際に、暗くして映画を撮ってみますと、細胞のこわれ方もずっと少ないし、何か細胞の状態が明るいままで映画を撮った時とちがうようです。

［堀川］photodynamic actionは治療に利用出来そうな気もします。

［高木］最後の図は4NQOの細胞周期に対する影響というよりも細胞数に対する影響をみていることにはなりませんか。

［勝田］そうです。

[黒木］生きている細胞でなくても、レントゲン照射した細胞をフィーダーにおいても4NQOの毒性は弱まります。

［勝田］そういうことは何を意味しているのでしょうか。培地にはありあまる程4NQOがあるわけですから、細胞数が多くなっても細胞１コあたりの4NQO量がうすまるわけではありませんし。

［堀川］私の実験からは、取り込んだ4NQOを4HAQOに変える能力の違いが細胞の4NQOに対する抵抗性の違いとなって現れてくるというようなデータになりつつあるようです。
それから、又photodynamic actionの実験ですが、4NQO処理後すぐ照射する実験の他に処理後の時間をかえて照射するとどうなるかもしらべると面白いですね。

［勝田］これからしらべてみます。私達はこれからL･P3をモデル実験に使いたいと思っています。L･P3は現在の所C3Hには腫瘍を作りません。L･P3は合成培地に増殖している細胞で、血清培地で飼われている細胞とは膜の構造が全然ちがうわけです。にもかかわらず4NQOの作用(今の所取り込み)が同じだということは4NQOの作用が膜構造には左右されないといえると思います。

《佐藤報告》

1. ラッテ肝(Exp.7)←4NQOはその後２匹のtakeで実験例49匹中16匹(33％)が発癌。

   対照群は10匹中０となった。現在最終復元動物が７ケ月を経過したので近く全動物を屠殺処理する。

   　復元接種動物が腫瘍死するまでの平均日数は188日であった。

   　腫瘍の組織像は肝臓癌と診断されるもの12例、癌肉腫と診断されるもの２例、繊維肉腫と考えられるもの１例、残りの例は腫瘍であることは間違いないが性格(ラッテ自然発癌？)がよく分らなかった。

   　核型分析<P> 　Exp.7 肝細胞株の対照株については前号に報告した。この対照株の総培養日数512日に当たる実験株526日の培養時における染色体と、動物復元後発生した腫瘍の再培養細胞の染色体分析をおこなった。

   （染色体数分布図と核型分析図を呈示）核型分析ではNeoplastic line即ち4NQOを投与された総培養日数500日以上の培養細胞では41にmodeがあり、50ケのMetaphase中に22ケの44％を示した。10ケのMetaphaseの分析を行った所、略同一の核型を示した。即ちMeta-Group 12ケ、ST-Group 7ケ、T-group 18ケ及び異型染色体４ケの計41である。異常染色体４ケ以外の染色体は略正常なラッテの核型である。（異常染色体４ケの模型図を呈示）腫瘍再培養細胞の染色体数は43にModeがあるので、分析可能な43の２ケのMetaphaseについて検索した所、１つは前記同様の４つの異型染色体Groupをもっていることが判明した。他の１つは異型染色体２つをもっていたが特異なGroupは存在しなかった。然し描写による検索では前記４Groupをもつ染色体型が他の染色体数の部にも広く認められた。極めて単純に云へばこの４Groupの発生が4NQOの作用によると考える。

   　上記のNeoplastic lineを動物に復元し出来たTumorを再培養したものの核型は（図を呈示）異型染色体はTumor lineの６Groupとなっていた。この場合Modeは43であった。幹細胞の数は22％であった。検索された10ケの核分析の内９つは同型であり、動物復元前時の特異的４Groupの他にsmall sizeのTeloが２ケ増加したものであった。動物復元前の4NQO処理培養細胞の中には今の所この型は見当らないが、それは培養細胞時にはPopulation中における％が低いためであろう。この点はギムザ標本及び復元動物の生存日数からも推定できる。（対照の培養細胞に現れる異型染色体図を呈示）此等の異型染色体が個々に現われる場合が多い。今後尚詳細に検討していく積りである。

   　4NQO耐性の問題：

   　4NQOによって発癌したと考えられる株細胞(Exp.7)と、その株細胞を動物に復元接種しTumorより再培養した細胞、及び対照株について継代培養と同時に4NQOを10-6乗Ｍ、10-7乗Ｍ、10-8乗Ｍに添加して48時間後の細胞数を比較した。（図を呈示）結果はNeoplanstic lineもTumorよりの再培養細胞(Neoplastic lineよりTumor cellを取りだしたもの)も共にControlに比較して耐性をもっていた。この場合の耐性は、既にDABの場合にも述べた様に薬剤中に長く存在したための耐性で腫瘍とは関係がない様に考えられる。

2. 動物復元　続き

   　動物番号146〜157の復元表を呈示する。

3. 培養ラット肺細胞←4NQO

   1967-6-1に生まれる直前のラッテの肺細胞をtrypsinizeして、20％BS＋YLEで培養し、4NQO実験を行っていたものの内、10-6乗Ｍの4NQOを33回処理したものでラッテ新生児皮下復元にTumorを発見した。腫瘍の性格は未だよく分らない。

4. ラッテ全胎児←4NQO

   　（５例の実験の一覧表を呈示）
   　動物復元観察日数は丁度６ケ月である。従って６ケ月でTumorをつくらない場合には結果は腫瘍形成がないことになる。５例中で実験RE-5、10-6乗Ｍ、100日処理のみが＋であった。

：質疑応答：

［安藤］ある濃度以下の処理では何時間処理しても効果がなく、それ以上だと10分でも効果があるといった、oll or noneの場合もあるから、時間の総計で比較するために濃度を同じに換算するのは少し変ですね。

［佐藤］逆にそういうことを証明するのに、こういう計算をしてみた積りです。つまりうすい濃度では濃い濃度での集計時間に達する程の長い時間処理しても悪性化はおこらないのだ、ということが数字で現せると思います。

［勝田］復元例で、同系の細胞なのにtakeされたり、されなかったりするのは何故でしょうか。

［佐藤］培養だけでつづけている系と、一度復元してtakeされ再培養した系では染色体の核型が多少ちがっています。そういう点から考えられることはRatの肝細胞の場合、全部が悪性化しているわけでなく、しかもそのpopulationが培養の時期によって変わるので、takeされたりされなかったりするということです。

［梅田］基本的なことですが、LD培地とYLE培地とはイーストエキストラクトのあるないの他に、pHもちがうわけですから、要素を二つ変えて比較するのはよくないと思います。LDとYLDにするべきですね。

［黒木］コロニーを作らせることは出来るのですか。系の一部が悪性化しているのなら、悪性細胞のコロニーを拾えば、動物への復元の問題は解決されると思われます。

［吉田］動物への復元実験の対照群の匹数が実験群に比べて少なすぎるようです。このデータですと対照群の中に変異細胞がいないとは断言出来ませんね。

［佐藤］それは私も痛感しています。これ以後の実験では対照群を増しています。

［勝田］何時も云うことですが、反復実験は同じ系の培養でなく、新しい系で追試した方がよいですね。

［堀川］耐性をしらべたgrowth curveの所で、耐性についてですが、takeされるようになった時までに添加された4NQOの濃度はどの位ですか。

［佐藤］濃度は一定でなく、かなり長く処理しています。この場合耐性は悪性と平行するものではなく、4NQOを添加していた期間に平行するものと考えられます。

［三宅］復元して出来たtumorの組織像は上皮性な感じがしますね。エオジンをよくとっているのは、ケラチン様物質があるのではないでしょうか。

［吉田］染色体の核型分析についてですが、１例でははっきりしませんが、本当なら面白いですね。私自身のデータからも染色体の変化と悪性化とが関係づけられる、ある染色体のパターンがあるようだとは考えています。

［勝田］ただ、１例では何とも言えませんね。

［安村］再培養した系の場合、43本でないものでも、この５本のグループを持っていますか。

［佐藤］たいてい持っているようですが、まだ正確にはしらべてありません。

［安村］再培養した細胞系を又復元するとtakeする率がよくなりますか。又復元前の細胞の染色体の中にtakeされた細胞の染色体と同じものがありますか。

［佐藤］50コ位しらべてみた所では見つかっていません。しかし、もっと沢山エネルギッシュにしらべてみたら見つかるのではないかと考えています。又培地や培養法をかえれば、悪性細胞をセレクト出来るのではないかと思います。

［安村］動物への接種細胞数はどの位ですか。

［佐藤］だいたい100万個位です。

［安村］矢張り何コ中に１コの悪性細胞がいるのかということを調べておく必要がありますね。それから、この５本のグループの染色体が確かに悪性と関係があるのだと言いたければ、ハイブリッドを作らせて、この染色体のはいったのが悪性だということまでチェックすればよいでしょう。

［吉田］実際にはなかなか難しいことです。この染色体があるから悪性化しているのか、或は他の染色体が無くなったこととの組合わせに於いて悪性化と関係があるのか判りませんね。それから4NQOが染色体変異を起こすことは確かです。このデータもその変異の一つでしょう。しかし4NQOによる悪性化が、こういう染色体変化に集約されるとは断言出来ません。

［佐藤］変異だけでなく、次に悪性化することを考えれば、変異したものが一定の方向に集約されることも考えられると思います。

［勝田］染色体の標本をみる場合、数えられないもの、しらべられないものが沢山あり、そういうものの中に問題がある場合も考えられます。

［安村］復元前の培養細胞の中に、この５本のグループがあるのか無いのか先ずしらべてみなくてはいけませんね。その上で５本のグループの中の２本の染色体がクサイという事実があれば、それがハイブリダイゼーションという手法で確かめられるのではありませんか。

［堀川］酵素活性と関係のある染色体の場合とは違って、腫瘍性と関係のある染色体というのは、すごく複雑でむつかしいと思います。

［安村］いや、私も腫瘍性を染色体でチェック出来るなんて事は否定の方に90％位ですが、若しできるとすれば大変面白いと思います。

［勝田］何にしても１例だけでエキサイトしなさんな。

［佐藤］私も１例だけで何とか言おうとは決して思っていませんが、ただこの例は理論的に考えやすかったので出してみたまでです。私として言いたいことは、この系の培養のpopulationの中に悪性化した細胞は少ないのではないかということ、又4NQOの作用したという証拠は残っているのではないかということです。

［勝田］佐藤班員の研究室でRatそのものの自然発癌率はどうですか。

［佐藤］非常に少ないようです。

［勝田］それも一応データとしてとっておいた方がよいですね。

［佐藤］復元実験のやり方を考えてみる必要を感じています。復元して長くおけばtakeされることがわかっているわけだから、もっと短期間で対照との比率に於いて悪性度をみることにしたいと思っています。

［安村］発癌剤によって悪性化する率が低いということは、Ratは発癌実験に不適当だということではないでしょうか。
それから接種数100万個の中、1､2コの悪性細胞が居たために動物にtakeされたとするなら、復元前にその100万個の細胞を寒天へまいてコロニーを作らせれば悪性のコロニーを1､2コ拾うことが出来るのではないでしょうか。現在の手法では、寒天法は悪性のコロニーを拾うために良い方法とされているわけですから。そうすればもっと高率にtakeされる系を作れるはずです。

［勝田］コロニー法ではpureなクローンはとれませんね。肝細胞を映画に撮っていて経験しましたが、分裂した娘細胞同志が一緒に居ずに離れてしまい、他の所から別の細胞が動いてきてくっついて、あたかも娘細胞同志のような顔をしていたりするのです。

［安村］クローンについては確かにそうですが、目的によっては定量的に扱えるということでコロニー法の利点もあります。

［藤井］腫瘍細胞には同種の抗体に抵抗性があるかも知れないということから、同種の抗体で悪性化した細胞をセレクト出来ないでしょうか。

《堀川報告》

　これまでの報告で培養細胞のもつ紫外線障害回復機構と4NQO処理による障害回復機構の間には何ら関連性のないことを示してきた。

　つまり紫外線に対して最も感受性株のブタPS細胞が4NQO処理に対しては最も抵抗性を示し、4NQO処理による障害回復の機構は紫外線照射によって生じるThymine dimerの除去機構では説明出来ないことがわかって来た。 　第２の段階として、4-HAQOに対するマウスＬ細胞、Ehrlich細胞、PS細胞の感受性を比較する問題が生じてきた。黒木さんより得た4-HAQO(国立がんセンター川添豊氏合成品)を使用した範囲では（図を呈示）、三者の細胞株間には感受性の差異は認められない。(これらはいづれも4-HAQOを含んだMedium内で約２週間培養期間中、それぞれの細胞を培養した際のcolony forming abilityからdetermineしたもので障害回復能よりもむしろ4-HAQOに対する耐性度をみたものであることに注意されたい！！）

　勿論現在の段階では4-HAQOの濃度分割が大きすぎるので正確な耐性度を比較することは不可能であるとは言え、本報No.6802に示した4NQO濃度−生存率曲線と比較して大きな違いのあることがわかる。また4-HAQOのtoxicityは生存率曲線でみた範囲では4NQOの10〜100分の１であることもわかる。

　従ってこれまでの結果を総合して考えると培養細胞間の4NQOに対する感受性の差異は、細胞間の4NQO透過性の差異で説明するよりも、4NQOを4-HAQOにreduceするreduction enzymeのactivityの差異で説明する方がよさそうである。

　このことは言葉をかえると、取り込んだ4NQOを4-HAQOにreductionする能力の高い細胞(つまりPS細胞のごときもの)では生存率で見るかぎりその毒性から受ける障害の度合が4NQOから受けるそれよりも少ないであろう。しかし発癌と云う立場からみると、このように4-HAQOにreductionする能力の高い細胞では発癌の可能性が高いと考えてもいい訳である。このような観点からみると、私が当初予想した考えがうまく説明出来そうで発癌のさいにtarget cellの存在を考えるのも面白い。

：質疑応答：

［堀川］（装置図を呈示）スターラーの上にのせたビーカーに水をいれて、その中にtubeを並べます。60cm離れた所から東芝500w引き伸ばし用電球で照射しました。

［勝田］可視光線で２時間照射すると、コロニーを作る能力が減少したというわけですね。RLC-10の増殖に対しては影響がありませんでした。奥村君から貰ったハムスターの細胞は悪性化しているものですか。 ［堀川］それについては、はっきり知りません。

［勝田］Chick brainにP.R.activityがあることになっていますが、どういうことでしょうか。何か他の酵素のside effectではありませんか。

［堀川］サイトクロムＣなどがそうではないかと言われていたこともありますが、現在では否定されて、P.R.activityは独特のものだと言われています。放射線による断裂のrecoveryが、若し腫瘍を材料にした場合、腫瘍性を失うとか、はじめに持っていた酵素活性を失うとか、misrepairingで説明できないでしょうか。

［吉田］胎生の早い時期とadultでは、そういう修復機能がちがわないでしょうか。

［堀川・勝田］ちがうでしょうね。

［勝田］細胞の全cell cycleを通じてP.R.enzymeがあるとすれば、stageによってrepairのちがうのは？

［安藤］定性的にはいつもあってもstageによって活性の違うことも考えられますね。

《高木報告》

1. 4NQO添加
   1. NQ-6

      　10-6乗：RL-2cells ２代目に２回作用させたものはあまりcell damageなく、２回目作用後２日後に継代した。10日後にはほぼfull sheetの状態になったので更に同濃度で２時間１回作用させた。今回は細胞は可成りのdamageをうけて殆ど脱落したが、約20日後にfoci２ケを認めた。うち１ケはpile upは認めないがfiberの形成がみられた。しかしこのcolonyの細胞の増殖はあまりよくない。

      　5x10-7乗：２回作用せしめた後継代し、更に同様にして２回作用せしめたところ殆どの細胞は脱落してしまった。約20日後にfoci　2〜3ケ認めた。一部にはやはりfiberの形成があり、またpile upの傾向も認められるがgrowthはあまりよくない。

      　2x10-7乗：この群ではcell damageは著しくなく、NQ処理にてもある程度細胞のgrowthは認められるが８回作用させたものでは最近growthがおちて来た。

      　現在まで明らかなtransformationは認めない。
      　対照：controlのgrowth rateは２代目が７日間で約3.5倍、３代目が10日で約２倍で、その後は継代時のcell damageがつよく、大体10日毎に継代しているが細胞数としては増加しない。

   2. NQ-7

      　10-6乗：第１回目作用後10日の間隔で２回目を作用せしめたが、約20日後に２ケのcolonyを認めた。１ケはpile upしないがfiberの形成が著明で、また培地が非常に粘稠になる。mucopolysaccharideの分泌を思わせる。 　5x10-7乗：３回作用後継代し、更に４回目を継代後10日目に２時間同濃度で作用させた。その後約20日経過するが、少数の細胞が残存しているのみでcolonyは認められない。

      　2x10-7乗：３回処理後２本に継代、１本はその後も同様に２時間ずつ４回作用せしめた。また別の１本はNQ 2x10-7乗Ｍを含む培地を使用して継代し、３日間放置した。細胞はガラス壁にはよく附着したが、その間増殖は認められなかった。３日経過後NQfreeの培地と交換し、細胞の増殖を待って更に１回２時間同濃度を作用せしめた。 　現在両者共growthはおちfocusも認めえない。

2. NG添加
   1. NG-11　RL-2cellsを使用

      　10μg/ml：１回の処理により細胞は著明なdamageをうけ約40日を経過したがfocusなど認められない。
      　5μg/ml：２時間ずつ４回作用せしめたがcell damageがつよく10μg/ml処理群と同様である。
      　1μg/ml：２回処理後継代、更に３回処理して継代、ついで２回処理し、合計７回作用せしめたものではgrowth rateは、５代目は７日間で1.4倍、６代目は７日間で３倍である。又２回処理後継代し、同様に５回作用せしめたものは、４代目は13日間で１倍、５代目は７日間で２倍の増殖を示している。

      　培養開始後60日目に固定し、giemsa染色したものでは対照に比して核の大小不同が著明である。
      　継代後10μg/ml、5μg/mlを作用せしめたものは、細胞のdamageがつよく現在までgrowthはみられない。
      　なお対照は５代目までは７日間で5〜13倍の増殖を示したが、６代目より殆ど増殖を示さなくなっている。
      　なおWKA ratの胃の培養については、その後検討を加えているが、培地としては可成りアミノ酸、ビタミンに富んだものがよい様で、目下系統的に検索中である。

   
   

：質疑応答：

［勝田］今朝安藤班員から、4NQO*を細胞にとりこませた場合、acid soluble fractionに結合する4NQO量の消長度が大きいと報告されましたが、発癌性はinsoluble fractionの方にあるのでしょう。

［高木］抗原としてはinsoluble fractionの方を使います。DNAについた4NQOは37℃加温で簡単にとれてしまうそうです。

［黒木］できたtumorの間で共通な抗原がありますか。

［高木］それも大きな問題だと思います。

［勝田］抗血清を作っても、どういう方法で抗体をcheckするかが問題ですね。蛍光抗体法はnon specificの抗体がどうしても混ってきてしまうし・・・。ごく最近、山本正氏からきいたところでは、ヒトのγ-globulinとマウスのそれとが交叉するものがあるそうで、immuno electrophoresisも問題をもっていることになります。

［梅田］h2proteinsとさっきのinsoluble fractionとの関係はどうでしょうね。

［勝田］まだ判っていません。H3-4NQOで処理して、初期は細胞のどこに4NQOがあるか判っていても、その後、細胞が増殖をはじめれば放射能はうすまって、追跡が困難になりますね。

［梅田］DABとかDMBAはh2proteinsの塩基性蛋白の部分につき、4NQOはSH基につくと云われていますね。

《黒木報告》

BHK-HA-1〜HA-7までの成績を表で示す。これらは(?)→マニラ(?)の予研分室→予研→山根研からのwild BHK、wild BHK-21より当研究室にて２回連続ひろったクローンC22、C22のクローンを３回連続のクローンC222を用いた。７例のうち配列は余り乱れず、しかし細胞はpile up、剥れやすく、このためコロニーの中心部はもり上り、まだらとなり、daughterコロニーが多くできるものが６例、その内２例は配列が乱れてcriss-cross様となるものが混じっている。あと１例はpolygonalなcellとなり、コロニーの形は丸い。又、5/7はBacto-peptoneなし寒天内の増殖能が獲得された。寒天内のコロニー形成率は20〜30％である。寒天内で増殖できるようになるまでの日数は、HA-4の21日、HA-5の63日までかなりのバラツキがある(HA-1の77日は、そのときはじめてagar cultureをしたので、いつから寒天内で増殖できるようになったかは明らかではない)。興味あるのは、この日数が、ハムスター胎児/4NQOのときのtransformationの日数と非常に似ていることである。

　☆コロニーの形態と寒天内増殖能の間には一定の関係がみられない。またコロニーの形態も培養によって異る。HA-7にのみみられたpolygonalなコロニーは肉眼的にもはっきりと区別できる特徴的なコロニーである。HA-4#3は、寒天内のコロニーをひろったcloneであるが、寒天内で高率にコロニーを作るにも拘わらず、コロニーの形態は“normal”と区別しがたい。これをみるに至って、コロニーの形態からのtransformationの判定をあきらめ、agar中のgrowthのみにtransformationの基準を求めた。全体的に云えることは、寒天内で増殖するようになると、細胞が剥れやすくなり、daughter colonyを作りやすいことである。寒天内増殖と剥れやすさの間に何らかの関係がありそうである。

　☆4NQO、4HAQOに対する抵抗性

以前と同じように、plating(200ケ/dish)後24hrsに4NQO、4HAQOを加える方法をとった。結果を表で示すが、抵抗性は生じなかった。
　☆染色体分析：寒天内growthだけでは心細いので、もう一つのmarkerとして染色体分析を試みた。結果を図に示すが、HA-4#5がmode40本である他は、すべて41本にmodeがある。数の上からでは、transformantsと“normal”の間に差はなさそうである。
従来BHK-21細胞は、44本♂の核型をもつと報告されてきた。そこで用いているcellがBHK-21細胞のvariantである可能性が生じてきたので、Moskowitzさんから、BHK-21/C13というクローンを分与してもらった。

☆BHK-21 clone13について

　BHK-21はBaby Hamster Kidneyの培養65日に突然増殖率が上昇し、establishされたが、それから19日目(total 65＋19＝84days)に分離したクローンの一つがC13である。C13は24cell generation増殖しharvestが10の8乗になったところで、大量にfrozen stockされている。StokerのLab.でtransformationの実験に用いられているのは、この凍結アンプレからもどして間もない細胞である＊。このことは、彼らのpaperの中でくり返して強調されている。このC13はwildのBHK-21に比してmalignancyの低いということもStokerらによって報告されている。当研究室にきたのは、StokerのLab.で凍結もどしてから10日(60 cell generation)経たものをMoskowitzのLab.で５日間隔で67passageしたものである。＊Nature 203,1964,p1355に詳しい。

　☆先ずこの細胞及びそのpolyoma virus.RSU transformantsのBacto-peptone dependencyをみた。（結果表を呈示）

全く予想しなかったことに、C13はBacto-peptoneがあってもコロニーを形成せず、またそのpolyoma RSV transformantsはB.P.dependencyを有しているということである。すると今まで一生懸命やってきたBHK-21細胞は、全く“variant”ということになり、すべての実験をやり直す必要となった。この他にもC13とwildはかなりの差があり(表を呈示）、例えば移植性はwildからC22は100ケでも100％takeする(C13は目下experiment進行中であるが、10万個接種３週間でtumorを触れない)、4HAQO、4NQOに対する感受性もC13とC22には差があり、C13の方が感受性で10-5.0乗Ｍ4HAQOではすべての細胞が死メツし、5x10-6.0乗Ｍがよさそうである。このような発癌剤に対する感受性の差はSachsらも報告している(Nature,200,1182,1963)。
　由緒正しい細胞を選ぶべきであることを痛感した次第です。

II．同調培養によるtransformatione(予報)

　２代目のハムスター胎児細胞をexcess TdR(7.5mM)によって(部分的に)同調させ、それぞれのphaseに4HAQO 10-4.5乗Ｍ１h.作用させることにより、発癌剤とcell cycleの関係をみようとするものです。（図と表を呈示） 　DNA合成は40％近くまで同調し、発癌剤処置はHA-50〜HA-58の９つの群をおき、それぞれの時間のときに処置した。

transformationの成否はまだ定かでないが、現在focusらしいものがみられているのは、HA-50、HA-52、HA-53、HA-54の四つである。さらに経過をみて(あと2〜3wks.)いくつもりである。
synchronousの方法もprimaryでconfluentしてG1でstopさせ、それをexcess TdR med.の中にうえこむ方法を検討しているところである。倒立でmitosisをみている範囲では、この方がよいようだ。

III．4NQO及びその誘導体の細胞生活環に及ぼす効果

　前に1)4NQOはRNA、DNA、protein合成を抑制するが、2)4HAQOはDNA合成のみ強くeffectiveなこと、3)またnon-carcinogenic Derivatives 4AQO、3-methyle 4NQOはいずれにも働かないことを示した。それらの作用機序をさらに分析する意味で、これらの物質の細胞生活環に及すeffectをみた。

1. 分裂細胞数の変化

   　ハムスター胎児細胞の培養にcarcinogenを加えると著しい増殖阻害がみられる。この変化をMitotic Indexで示した（図を呈示）。

   　☆第２代のハムスター胎児細胞の培養に、4HAQO、4AQOをそれぞれ10-5.0乗Ｍづつ加えて培養し、１時間毎にサンプリングした。 MIはcontrol及び4AQOでは0.7〜1.6％(大部分は1.1〜1.4％)の間にある。4HAQOも１時間後はcontrolと同じ幅の中におさまるが、３時間から下降し始める。

   　☆このような分裂阻害をコルヒチンを加え累積分裂指数で表す（図を呈示）。 前回と同じ所見が得られた。4NQOの強い分裂阻害が目につく。4HAQOは３時間後からplateauを示し、4AQOはコントロールと差がない。興味があるのは、3-methyl 4NQOが軽度の、しかしrecoverするG2blockを示すことである。

   　☆さらに、それぞれでG2時間を測定すると、コントロールと4AQOは3hrs.、4HAQOは4.8hrs.と、G2時間の延長が4HAQOに認められた。しかし、この程度のG2delayでは分裂阻害を説明することはできず、(G2delay)＋(G2期の細胞の傷害)と考えねばならない。この成績は、前に吉田俊秀先生の得た成績と一致する。

   　☆次に細胞増殖に及す影響をみた（図を呈示）。細胞増殖は4HAQO添加後、３時間は全く影響を受けない。細胞数の減少は６時間より少しづつ表れ、24時間後に最底となる。このように死んでいく細胞が、MI阻害とどのような関係にあるのか問題となる。

2. G1 blockとＳ期の阻害

   　4NQO、4HAQOはG1、Ｓ期に対してはどのように働くか。

   　☆C14-TdR、C14-UR、C14Leuの酸不溶性劃分へのとりこみを、細胞数の変化しない４時間に限って調べた。 ハムスター胎児２代目をFalconシャーレ当り40万個うえこみ、培養2〜3日目に4HAQOとisotopeを同時に加える。いずれも0.1μc/ml。時間後にpronase→1.0N PCA coldを加える→0.5N PCA→遠心→Ether･EtOH･CHCl3(2:2:1)→遠心→HCOOH→Planchet→Gasflow counter。＊Leuのとりこみのときは、PCA 100℃ 30minの加水分解を行う。 ここで分ったことは、最初の４時間で、すでにDNA合成の低下が起っていること、RNA合成もDNAと同じように阻害されるが、proteinはinhibitされないことである。

   このうちDNA合成の低下の二つの理由としては、G1 blockと、Ｓ期のDNA合成の低下の二つの理由が考えられる。
   　☆そこでG1 blockをみるために、H3-TdRのcontinuous labelingによるLIの累積曲線をとってみた。（図を呈示） MIのときと同様に4NQO 10-5.5乗Ｍ、他は10-5.0乗Ｍ加え同時にH3-TdR 0.1μc/mlをcontinuous lab.した。
   4AQO(バラツキがあるが)はcontrolと差がなく、4HAQO、3-methyl4NQOはcontrolより低い。4NQOはlabeling indexは殆んど上昇しない。ハムスター胎児細胞のG1は、約3.6hrs.であるので、４時間までLIが低いことは、G1 blockの存在を示唆する。それ以後の累積LIの低さはG1＋G2 blockによるものであろう。

   　☆問題のＳ期のDNA合成阻害については、前の報告(月報6712号)から、当然予想されるところである。これからpulse labelingによるLIとgrain countの推移をみるexp.をセットしようと思っている。

：質疑応答：

［吉田］吉田肉腫に4NQO処理してもG2 blockがあります。染色体breakageという意味で。他の期にはありません。

［勝田］最後のデータで考えたのですが、4NQOが4HAQOになって働くのなら、両者のカーブは同じでよい筈ですが、ちがうのは4NQOの毒性のためでしょうかね。それからシンクロは40％位で良いのですか。

［黒木］primaryは仲々むずかしくて、これでもうまくなった方です。4NQOと4HAQOのカーブがちがうのは4NQOの毒性のためと思います。

［勝田］映画で見ると、どうもmitosisとは関係なく、細胞が死ぬように思われます。4NQO処理の場合ですが。

［堀川］mitotic deathといってもその辺を中心にして起る死、という程度の意味です。

《三宅報告》

この10-6乗Ｍについて詳しく時間経過を追ってみると、４時間目まで漸減して来て、それから以後はL.I.は再び上昇してゆく。

10-6乗x5Ｍについては、前に月報に述べたように、３時間目に０となり、立上ることはない。

次にH3-TdRと4NQOを同時に入れてみると、10-6乗Ｍでは実験群のL.I.開始後数時間で少し落ちるが、爾後そのカーブは対照とかわることはない。5x10-6乗Ｍとなると、前に述べた様なカーブになって３時間で実験群は０となる。 これと同じことをＬ株細胞を用いて行った。このＬのtg＝21hr.、ts＝8hr.、tG2＝7、tG1＋tM＝6hr.であった。

その結果はControlにしたＬ細胞でも10-6乗x5Ｍで３時間以内にL.I.が減少したことから、4NQOはG1-blockの他にG2-block、又S-blockをきたすと考えられ、いずれとも断言しえないことになった。

目下この２つの細胞について、同調培養を行って、それを決定したいと考えている。
（各実験についての図を呈示）

：質疑応答：

［難波］4NQOは培地に入れつづけでしょうか。

［三宅］そうです。4NQOとH3-TdRとを入れつづけたものと、4NQOは入れつづけH3-TdRは45分のflush labelingしたものがあります。

《梅田報告》

1. Iの方式では大きな細胞塊が残っており､それからの生え出しが非常に良く、特に肝細胞の増生が良い。しかし間葉系のendothelと思われる細胞も旺盛に増殖している場所もある。主にこの２種の細胞群から成っている。

   　IIの方式では2〜5ケ位の細胞数からなる中等大の細胞塊も沢山残っているが、一応disperseした状態からの細胞からも細胞が増生する。50万個cells/mlの接種数で6〜8日後には殆完全なmonolayerを作る。その時の肝細胞増生は全細胞の1/3〜1/2を占め島を作っており、その間を間葉系(?)の細胞が占めている。間葉系の細胞を良く見ると、大型の細胞質のひろがったエオジンに濃染する細胞で核も大型長楕円形で核小体は不規則形2〜3ケあり核全体もヘマトキシリンに淡く染る細胞(endothel?)と、やや小型で核が丸或は楕円で核小体は1〜2ケ丸くくっきりと染る肝細胞核に似た細胞(胆管上皮?)がある。

2. 培地として、MEM＋20％CS、MEM＋10％tryptose phosphate broth＋10％CSを使用、LD＋20％CSと比較してみた所、前２者では良く細胞は増生するが殆んど間葉系細胞で占められ、肝細胞と思われる細胞は、あちこちに数ケ宛細胞質に空胞を生じ、変性して散在する。

3. １例IIの条件で生後15日のラット肝の培養を試みた所、トリプシン・スプラーゼ処理のpipettingにより細胞の大多数が破壊され、約0.5gの肝組織からスタートして50万個cells/ml ２mlの生細胞しか得られなかった。培養開始後沢山のcell debrisがあり、２日後にそれを培地で数回洗い去ってから培養を続けた所、生後５日肝培養と同じ様に、肝細胞も間葉系細胞も増生した。ただし、一部に生後５日肝では見られなかった敷石状の配列を示す細胞増生がみられた。

4. IIの条件で１例生後２日のmouse肝の培養を試みたが、肝細胞の増生は良くなく、肝細胞の大型化多核化が見られ分裂障害を思わせた。

5. IIの方法で培養した生後５日のラット肝培養細胞にDABを投与した。DABは10mg/mlの割合にDMSOに溶かし、培地で稀釋した。100μg/ml、32μg/mlで肝細胞の著明な空胞変性が見られたが、他の間葉系の細胞では変化が見られず健全に見えた。10μg/mlでは肝細胞の空胞は見られない。

6. 同じく黄変米の毒素であり、肝癌源物質であるルテオスカイリン投与を試みた。1μg/mlで肝細胞だけすべて３日後にcoagulation necrosisが起り、間葉系細胞だけ残るのが見られた。0.32μg/mlでは萎縮した核をもち細胞質に空胞のある肝細胞が見られた。

：質疑応答：

［梅田］中間型のような細胞とendothelばかりになってしまいます。医科研の斎藤先生の仰言るには、肝のshaltstuckの細胞ではないか、というのですが・・・。

［佐藤］小型で核の丸い三角のような細胞がshaltstuckだと思います。とにかくいろんなものが出てきますね。私はcolonyにして同定しようかと思っています。

［勝田］箒星のような細胞で、細胞質に平行したセンイ状構造のみられるのは、他のorganをcultureしても出てくるので、血管の内被細胞ではないかと思っていますが・・・。映画でみるとこの細胞は動きません。

［安村］箒星というのはどんな臓器でも出てきますね。

［勝田］小さくてよく動きまわる、おそらくKupferと思われるのも見られます。

［佐藤］平たく拡がった細胞では判らないから、塊にして切ってみようか、と思っています。

［勝田］explant cultureして、反射光源で顕微鏡映画をとると、どんなところからどんな細胞が出てくるか判ると思います。

［藤井］班長のところの肝臓のcell lineは実質細胞ですか。

［勝田］株になったのはほとんど実質細胞だと思います。

［藤井］Rat肝を抗原にして作った抗体でcheckしても、培養系の肝細胞では沈降線が出ないので、どういうことなのかと思っています。 ［勝田］培養で増殖系になった肝細胞を抗原にして抗血清を作ると、その結果は変るかもしれませんよ。

《吉田報告》（Abstractの提出がなかったので概略を記す)

：質疑応答：

［吉田］他にもありますが、特にＸに強いのです。

《安村報告》

　先月の月報の2-6にふれておきました問題について、予備的にあたってみました。アルビノハムスター腎細胞の２代目の培養をふたたびPlatingしてコロニー形成をみました。細胞数は1,000、2,000、4,000、8,000個。MediumはＥ：DM-140培地のうち塩類溶液の組成のみEarleの液＋コウシ血清10％、199：199液＋コウシ血清10％、Ｄ：DM-140＋コウシ血清10％。（結果の表を呈示）

　1-1．コロニー形成数からは有意義の差がありません。またコロニー１こ１この大きさにも差がみとめられません。ただPlating efficiencyが初代培養の10倍近くなっているのが誤算のひとつでした。初代と同じくコロニーの大きさが小さく、たかだか20~50/コロニーというところで、やはりクローン化できません。

　1-2．mediumの種類によってP.E.に差がでなかった理由は一つには、細胞が最初の２週間Ｄ液で培養され、ついでちがっmediumにかえられ(３週後に判定、つごう５週間培養)たため、P.E.は最初のＤ液によって決められてしまったのかもしれません。こんごこの問題をしらべる必要があります。

　1-3．Plating efficiencyの上昇はひとつには、まかれた細胞のViabilityによるものと考えられます。初代では総細胞数の50〜60％がviableで、２代めのものはほとんど100％に近くviableでしたから。

：質疑応答：

［佐藤］single cellの比率はどの位ですか。

［安村］はじめは50％位ですが、２代目になるとほとんど100％です。

［佐藤］２代目にplating efficiencyがそう上るというdataはあまり聞きません。

［安村］もう一度やってみようとは思いますが、トリプシンのかけ方などに影響されるのではないですかね。
5〜80％位のひらきが、培地のlot No.によって出るというようなこともあります。

《山田報告》

　即ち細胞表面における抗原抗体反応を細胞電気泳動法により量的に測定するためのfirst stepの実験です。今回は最も単純な方法としてアルブミンに対する脾細胞抗体産生の程度を調べてみました。具体的には、抗原性の異なる卵白アルブミンと牛血清アルブミン（各3mg)をFreundのadjuvantと共に週二回、それぞれラットの皮下に注入し、合計四回感作後、一週間をおき、ラットの脾臓を摘出。鋏で細切し、looseなホモゲナイザーでかるくこすり、脾細胞浮遊液を製作。この感作細胞に各々抗原であるアルブミンを37℃30分接触させた後に生食にて洗浄し、1/10Ｍヴェロナール緩衝液(pH7.0)をメヂウムとして細胞電気泳動度を測定した。

　３回の実験結果（表を呈示）、それぞれの抗原であるアルブミンと接触した場合に選択的に感作脾細胞の泳動度は低下し、両アルブミンで感作された脾細胞は両アルブミンの接触により共に泳動度が低下しています。

　しかし、この抗原アルブミンによる電気泳動度の低下は必ずしも大きくはない。従来の報告によると、脾における抗体産生細胞は数％であるとされて居ますので、実際の抗体産生細胞表面に抗原のアルブミンが結合し、その表面の荷電をマスクし、泳動度を低下させる程度は更に大きいと考えます。

　従って今後、抗体産生細胞のみをえらび出して、その抗原の表面結合による荷電の低下を測定すべく工夫している所です。

　今回の成績により細胞表面における抗原抗体反応を直接細胞電気泳動法により測定できるという確信を得ましたので、次に悪性化に伴う細胞表面の変化や、宿主の抗体産生細胞の認識に、この免疫細胞電気泳動法を用いようと計画中です。